50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：每毫升血清中补体含量（单位）=（1/血清用量）×稀释倍数。
该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：x=k[1/(1-y)]1/n。假定X=加入的新鲜血清量，y=
溶血的百分率，以小数表示，V=斜率，k=常数，转变成对数，上述公式就变成：logx=logk+1/n
log[y/(1-y)]，当以50%溶血作为终点时，y/(1-y)=0.5/(1-0.5)=1，代入上述公式，log x=log k+1/n
log1，由于-log1=0，log x=log k，x=k，也即表示补体的50%溶血单位k就是加入的新鲜血清量。
材料及器材
使用时取此原液50ml，加90ml蒸馏水，经高压灭菌后即可使用。加入100%硫酸镁溶液1ml，可增强补体的效能；
2、绵羊红细胞悬液（1×10g/ml）；
3、溶血素（2U）；
4、被检血清（新鲜豚鼠血清）；
5、水平离心机；
6、水浴箱；
7、721型分光光度计。
方法
1、浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制 取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测 O.D值为DI按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。
Vf=Vi(Di-Ds)/Ds，Vi为配制的50%细胞悬液体积，Vf为于一定量5%细胞悬液中应加入稀释的ml数Ds为已知标准化的1×100 个细胞/ml悬液的OD540值-0.385。
2、致敏绵羊细胞 取绵羊红细胞悬液（1×102/ml）加等量的溶血素（2U/ml）。充分混合。置37℃水浴中作用30分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成 5×108/ml致敏羊红细胞。
3、补体CH50单位测定
（1）按下表加样；
（2）将各管充分混合，置37℃水浴中60分钟（摇动1～2次，以免红细胞下沉）；
（3）从水浴中取出后，立即将各管以2000转/分离心10分钟，将各管上清液分别移于另一试管；
（4）测定各管上清液OD值（波长＝540nm）。
4、补体CH50单位的计算
从测定管（第1～5管）及溶血对照管（第6管）的OD值中减去红细胞对照管（第7管）的OD值。再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度OD值（80/800ⅹ该管实际量ⅹ第8管OD值）。即为测定管的校正OD值。然后计算各测定管的溶血率（y值），再计算各管的y/(1-y)值。在双对数坐标纸上，以y/(1-y)值为横坐标，血清用量为纵坐标，得到一条直线。由于50%溶血（y=0.5）的y/(1─y)值等于1。即可由横坐标等于1的一点，在直线上求得在纵坐标上相应的截距，此即产生50%溶血的待测血清实际用量。最后，按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性，以单位/毫升表示之。
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