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原代细胞的培养与建系-2

2020.9.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

(四)骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
取上述标本时,除严格无菌,注意抗凝外,还要尽快分离培养,一般无需其他处理,离心后,用无钙、镁PBS洗两次,再用培养液洗一次后即可培养,不宜低温存放。具体操作详见后面有关章节。
(五)动物组织取材
1、鼠胚组织取材
首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物,然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中,5分钟后(注意时间不能太长,以避免酒精从口或其他通道进入体内,影响组织活力),取出动物,在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢,切开皮肤,用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤,用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾,把动物反包,暴露躯干,然后再固定,更换无菌解剖器材,采用无菌操作法解剖取出胚胎。
2、幼鼠胚肾(或肺)取材
幼鼠采用上述方法处死消毒后,腹部朝上固定在木板上,先切开游离毛皮并拉开至两侧:然后采用无菌法打开胸腔取肺,或背部朝上固定在木板上,先将背部毛皮切开游离并拉向两侧,然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
(六)人胚体组织取材
在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒,无菌法取人胚肺(肾),方法与鼠类相同。
(七)鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材
取孵化至适当胚龄(9~12天)的胚蛋,用照蛋灯在暗处灯检,若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋,说明胚体发育良好,并用有色笔划出气室和胚体位置。将胚蛋置于蛋架上,先用温水清洗蛋壳,再用75%酒精棉球擦干,经碘酒、75%酒精消毒后,在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室,沿气室边缘去除蛋壳,再用眼科镊撕去壳膜,暴露出鸡胚,再用弯头镊轻挑起胚头,取出胚胎,放入无菌平皿中,解剖取材。
第二节 原代细胞的分离和制作
人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即使采用1mm3的组织块,也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长,若需获取大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采用的方法如下:
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以避免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗一次后,调整适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采用离心后的细胞分层液,因为,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。
二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料,由于细胞间结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,形成细胞悬液,可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
(一)机械分散法
所取材料若纤维成分很少,如脑组织,部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

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