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细胞破碎技术的基本概念及其基本方法-2

2020.9.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

(3)胶体磨

胶体磨的基本原理是流体或半流体物料在离心力的作用下,强制通过高速相对运动的定齿与动齿之间,使物料受到强大的剪切力,磨擦力、高频振动和高速旋涡等复杂力等作用,有效地被粉碎、乳化、均质、混合,从而达到精细超微的效果。定转子间的高速相对运动是使胶体磨工作获得物理微细度的主要条件,只有提高磨盘的精密度与线速度,才能达到良好的加工效果。

2. 物理破碎

(1)压榨

压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa~2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法,但仪器费用较高。

(2)冷热交替

冷热交替是在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎,细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。

(3)反复冻融

反复冻融是将待破碎的细胞冷至-15℃~-20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。

(4)超声波

超声波是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时,时间要长一些,处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温,防止过热。

3.化学与生物化学破碎

非机械法有化学法:采用化学试剂处理细胞,溶解细胞或抽提细胞组分酶解法利用酶(溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等)反应分解破坏细胞壁上特殊的键,以达破壁的目的。需与其它方法配合使用(辐射、渗透压冲击、反复冻融法等)途径:在细胞悬液中加酶或采用自溶作用

(1) 有机溶剂

有机溶剂是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞,

可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此技术也可以与研磨法联合使用。
(2)自溶

将新鲜的生物材料存放于一定的pH 和适当的温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来,此法称为自溶法。该法使用时要特别小心操作,因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏,同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。

(3)溶胀

低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。

(4)酶解

用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,处理15分钟,可以专一性地将细胞壁分解,释放出细胞内含物,酶解破碎适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA 时,可采用溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁,而在破酵母细胞时,常采用蜗牛酶(来自蜗牛),将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中,加1%蜗牛酶,在30℃处理30分钟,即可使大部分细胞壁破裂,如同时加入0.2%疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨联合使用

(5)渗透压冲击法

胞放在高渗溶液中,由于渗透压作用,细胞内水分向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压发生突然变化,胞外的水分迅速渗入胞内,使细胞快速膨胀而破裂。

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