动物骨髓细胞染色体的制备与观察-2

二、染色体制备

各种动物骨髓细胞染色体的制备方法基本都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备的过程。

1. 取健康小鼠一只，按每10g体重由腹腔注入含量为0.02% 的秋水仙素0.3ml（此步在实验前12～24小时完成，哺乳动物在实验前2～4小时完成）。

2. 将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。

3. 用剪刀、镊子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结，迅速用5ml注射器抽取0.075mol/l的kcl溶液，从一头插入骨髓腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，直至骨髓腔变白。此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用镊子或吸管取出。加低渗液至5ml或8ml刻度，放入37℃恒温水浴箱内低渗处理25分钟。

4. 低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3﹕1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。1～2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平，使两支管的重量相等，然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1 500r/min 离心5～8分钟。

5. 取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6～8ml，用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37℃水浴箱中固定15～20分钟。

6. 再取出离心管，配平后离心5～8分钟，转速同样为1 500r/min。离心完毕，去掉上清液，再加入1ml左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。

7. 取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，再用口吹散滴液，置于酒精灯上微微火烤，最后放玻片架或玻片盒中晾干。

8. 将晾干的玻片放入吉姆萨应用液染色缸中，或将玻片平放于桌上，将染液滴在片上染色。染色10分钟后，用蒸馏水或自来水小心冲去染液，电吹风吹干后镜检。

三、染色体观察

将制好的玻片置于显微镜下，首先观察标本的制备效果，检验操作过程是否正确。一般来说，制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。但最重要的是分裂相要多。分裂相的多少主要取决于秋水仙素的用量和时间。秋水仙素还影响染色体的形态，如用量过大，常使染色体过于缩短，不利于观察。

青蛙体细胞的染色体数目(2n)为26条，性染色体机制为xx - xy，即雌性为xx，雄性为xy。

染色体的形态随青蛙种类不同略有差异，主要表现为亚中着丝粒染色体的序号和数目不同，如黑斑蛙的亚中着丝粒染色体为3、7、8、11、12等5对染色体，金线蛙为3、7、11、12等4对染色体，虎纹蛙为3、6两对染色体。
小白鼠的染色体数目（2n）为40条，但全部为端着丝粒染色体，大小区别不明显，较难分组编号。

图 6-1 小鼠染色体核型

大白鼠的染色体（2n）为42条，家兔的染色体（2n）是44条。

观察染色体时，不需加盖玻片，镜下先用低倍镜调好焦距，找到无离散，无重叠，形态好，可记数的一个分裂相，然后转高倍镜或油镜观察、记数，观察完毕后也不需擦试玻片，这样的玻片可保存数月。

表6-1 几种动物染色体形态特征

[注意事项]

1. 腹腔注射秋水仙素溶液时，注意不要使针头损伤动物内脏。

2. 制片所用离心管、吸管等勿必洗涤干净，否则细胞会滞留于管壁收集不到细胞导致实验失败。

3. 离心时，离心管一定要先平衡，然后在离心机中对应放置。

4. 使用药品时要注意药名标签，注意使用正确浓度。

5. 观察计数染色体数目时，观察的分裂相一般要在10个以上，这样计数才比较准确。