染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 实验

实验概要

染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。主要流程有：甲醛处理细胞-收集细胞，超声破碎-加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合-加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀-对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合-洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物-解交联，纯化富集的DNA-片断-PCR分析。

实验原理

基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

主要试剂

1. 37%甲醛
2. 甘氨酸
3. PBS
4. 蛋白酶抑制剂
5. RnaseA
6. 0.5MEDTA
7. 1MTris.HCl（PH6.5）
8. 10mg/ml蛋白酶K等。

主要设备

1. 10cm平皿
2. 水浴锅
3. 细胞刮刀
4. 超声破碎仪
5. 15ml离心管
6. 高速离心机
7. 交联仪等。

实验材料

培养好的细胞

实验步骤

1. 细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)

   1) 取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。

   2) 37摄氏度孵育10min。

   3) 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

   4) 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

   5) 细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

   6) 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×10⁶个细胞。这样每100ul溶液含1×10⁶个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×10⁶个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×10⁶个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

   7) 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

2. 除杂及抗体哺育(第一天)

   1) 超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验，其余保存于-80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

   2) 在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4度颠转混匀1h。

   3) 1h后，在4摄氏度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

   4) 取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

3. 检验超声破碎的效果(第一天)

取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

4. 免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)

   1) 孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4度颠转2h。

   2) 4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

   3) 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：

      a. 低盐溶液一次

      b. 高盐溶液一次

      c. LiCl溶液一次

      d. TE buffer两次

   4) 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS，100ul1MNaHCO₃，800ulddH₂O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

   5) 解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65度解交联过夜。

5. DNA样品的回收(第三天)

   1) 解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37度孵育1h。

   2) 每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。

45度处理2h。

   3) DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH₂O。

6. PCR分析(第三天)

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之，ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。