双抗夹心 ELISA

实验概要

夹心  ELISA 法是应用两种抗体协同测定抗原含量的方法（即：捕获抗体和检测抗体）。因此抗原必须包含至少 2 个能被抗体识别的抗原位点。在夹心  ELISA  中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以被用作捕获抗体和检测抗体。单抗识别单一的抗原表位，可以区别抗原的微小差别，使抗原得到更精确地检测和定量。多克隆抗体通常被用作捕获抗体，以捕获尽可能多的抗原。

夹心 ELISA 的优势是样品在分析前不需要纯化，检测灵敏度高（灵敏度是直接法或间接法的 2-5 倍）。

实验步骤

1.   包被捕获抗体

1)   用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释捕获抗体至浓度 1-10 μg/ml，包被酶标板。

2)   封口膜覆盖酶标板，于 4 °C 孵育过夜。

3)   倒掉包被液，用磷 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

2.   封闭和加样品

1)   封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点,每孔加 200 μl 含 5% 脱脂奶粉的 PBS 的封闭液。

2)   封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少 1-2 小时，或者方便的话 4 °C 孵育过夜。

3)   每孔加 100 μl 适当稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与标准曲线相比较，每块板都要做标准（做两份或者三份）和空白对照以保证精确性。37 °C 孵育 90 分钟。

4)   倒掉样品，PBS 洗板 2 次，每孔用 200 μl。

3.   用检测抗体和二抗先后进行孵育

1)   每孔加入 100 μl 稀释好的检测抗体。

2)   封口膜覆盖酶标板，室温孵育 2 小时。

3)   PBS 洗板 4 次。

4)   加入标记二抗，每孔 100 μl，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度（参照使用手册）。

5)   封口膜覆盖酶标板,室温孵育 1-2 小时。

6)   PBS 洗板 4 次。

4.   检测

使用多通道移液器加入底物溶液，每孔 100 μl（或 50 μl）。