前纤维蛋白与新型QuilA 佐剂组成的...

实验概要

本实验把传统的四种佐剂组成了一种复合物，形成了一种新型佐剂，然后再用这种新型佐剂与前纤维蛋白结合形成疫苗，从体重增加量和粪便卵囊排出量，肠道病变积分，以及重组前纤维蛋白抗体反应情况，淋巴细胞增殖，细胞因子mRNA的量化水平等方面来评价该疫苗的保护效力。

实验原理

通过原核表达系统对堆型艾美耳球虫的前纤维蛋白进行了原核表达，收集纯化后与新型的QuilA 佐剂结合形成一种新的亚单位疫苗，通过动物实验可以来评价这种新型疫苗的免疫保护性。

主要试剂

Quil A，Cholesterol，DDA，Carbopol，TRIzol，DNase I，WST-8 T4DNA连接酶，限制性内切酶，质粒小提试剂盒，DNA胶回收试剂盒

主要设备

荧光定量PCR仪，摇床，伯乐电泳仪，台式高速冷冻离心机

实验材料

鸡：一日龄的小公鸡
球虫：堆型艾美耳球虫
细菌：DH5α大肠杆菌
质粒：pMAL plasmid

实验步骤

1.   重组前纤维蛋白的表达和提纯：从堆型艾美耳球虫的的cDNA文库中克隆出前纤维蛋白基因，其全长为1086bp，再将其亚克隆到pMAL质粒中，再将构建好的质粒转化到DH5α感受态细胞中，用1.0mM的IPTG在37℃条件下诱导表达3小时，离心收集菌体，在冰上破碎菌体，进行SDS-PAGE及Western  blotting 对蛋白进行鉴定。

2. 用新型的重组前纤维蛋白疫苗去免疫，然后进行感染。其中新型佐剂的组成如下：12.0 ug/ml of Quil A，12.0ug/ml of cholesterol，0.6ug/ml of DDA。首免在一日龄，二免在一周龄且在相同部位进行。

3. 攻虫及体重增加量和粪便卵囊排出量的测定。在二免7天后用每只鸡10000个卵囊的剂量来感染鸡。感染当天和感染后9天分别进行称重。在感染后第6天到第9天收集粪便对卵囊进行计数。

4. 重组前纤维蛋白抗体反应的测定。二免后第7天每组杀4只鸡取血，分离血清，用ELISA 检测特异性抗体的含量。

5. 肠道病变积分。感染后第9天每组取5只鸡进行盲肠病变计分，每只鸡盲肠由三个不同的人分别进行计分，然后取平均值。

6. 淋巴细胞增殖。二免后7天每组取4只鸡采外周血，将血细胞加到指定的培养基里使得细胞浓度为5.0×10⁶/ml，然后在包含10ug/ml前纤维蛋白的96孔板中41℃，5%CO₂的条件下孵育48小时，最后分析其结果。

7.   细胞因子mRNA的量化水平。二免后7天取没感染鸡的十二指肠，将其将其切成几段，用含有100U/ml链霉素的Hank’s洗三遍，洗完后用外科手术剪刮掉粘膜层，用TRIzol提取总RNA,  然后将RNA反转录成cDNA,再找到各种所测细胞因子的引物序列，进行荧光定量PCR。所测的细胞因子引物序列如下图：

8. 数据分析。用SPSS 15.0软件进行数据分析。