高效液相色谱量级 [分析，制备和工程]
我们已经讨论了高效液相色谱如何提供分析数据，用于定性和定量样品中的化合物。然而，高效液相色谱也可以用来纯化和收集所需的每一个化合物，在流通池下游使用组分收集器。这个过程被称为制备液相[如图 K].
在制备液相中，科学家可以收集每个流出色谱柱的组分[例如：在本例中，黄色，之后红色，之后蓝色]。图 K: 高效液相色谱系统用于纯化：制备色谱法馏分收集器在特定的时间段，选择收集纯化了的组分。收集瓶可移动，从而使每瓶只收集单个峰的组分。科学家确定纯化的程度和数量的目标。结合样品的复杂性，所需组分相对基质的性质和相浓度等考虑，这些目标，又决定了需要处理的样品量和高效液相色谱系统的处理量。总的来说，随着样品量的增加，高效液相色谱柱尺寸将会加大，泵也会需要更高的体积流速。决定一个高效液相色谱系统的处理量称为选择高效液相色谱的量级。 表 A 列出各种高效液相色谱的量级及其色谱分离目标。
通过特定地匹配HPLC的固定相和流动相来最大化选择性-即获得两组分的最大分离度-在决定一个分离过程所需时很关键[参考"讨论高效液相色谱分离模式"]。容量成为衡量匹配上样量的柱体积[Vc]和选择适当颗粒[决定压力和效率，参考分离能力的讨论]的关键。柱体积，填料床长度[L]和内径[i.d.]，决定填料多少。(如图 L).
Figure L: HPLC Column Dimensions
总的来说，高效液相色谱柱长度[L]在 20 毫米到500 毫米之间，内径[i.d.]在 1 毫米到100 毫米之间。随着色谱量级的增加，柱尺寸增加，横截面积增加。为了优化通量，流动相流速必须与横截面积成比例增加。如果较小的颗粒要获得更强分离能力，泵必须设计成能承受更高反压下的更高流动相体积、流速。表 B 列出一些简单的挑选准则，为每种色谱量级推荐的色谱柱直径和颗粒尺寸范围。
例如，半制备级液相[红色 X]可以用内径10 -40 毫米装 5 -15 微米的颗粒。柱长度可根据需要纯化的化合物的量和要求分离的程度计算出来。当你放大分离处理量时，沃特世制备计算器软件 CD 可以帮你恰当地选择色谱柱和设定其他操作参数，如流速。
高效液相色谱柱硬件
一个色谱柱管路和配件必须填有决定分离效果的色谱柱填料[固定相]。它必须能够承受生产过程和使用中的反压。而且，它必须是样品入口和分离的谱带出口控制良好[无泄漏，最小体积和零死体积]的流路，而且相对于分离系统[样品，流动相和固定相]来说具有化学惰性。为承受尽可能高的压力，大多数色谱柱由不锈钢制成。当分析特殊化学品或生物制品需要惰性表面材料时，也可能会用到尽管只能承受较小压力的 PEEKTM [一种工程塑料] 和玻璃[图 M-1]。
玻璃制色谱柱壁有视觉优势。在图 M - 2 的照片中，当样品谱带还在色谱柱中，传输被停止。你可以看到样品混合物中的三种染料已经在床层中分开，黄色分析物移动最快，将要流出色谱柱。
图 M-2: 色谱柱内部
分离性能 - 分离度
两种化合物分离的程度称为色谱分离度[RS]。 由色谱柱决定的总体分离能力或分离度的两个主要的因素是，机械分离能力：由色谱柱长度，粒径和填料床层的均一性决定，和化学分离能力：由填料和流动相对化合物的物化竞争决定。效率是衡量机械分离能力的指标，选择性是化学分离能力的指标。
机械分离能力 - 效率
如果色谱柱床稳定均一地填充，它的分离能力就由柱长度和颗粒大小决定。机械分离能力，也叫效率，通常以塔板数[符号是N]来测量和比较。较小颗粒色谱床有较高效率和反压。对于固定的颗粒大小，增加色谱柱长度可获得更强的机械分离能力。然而，代价是色谱运行时间延长，更多溶剂消耗和更高反压。减少色谱柱长度可以减小以上变量但也降低了机械分离能力，如图 N 所示。
图 N: 色谱柱长度和机械分离能力 [相同颗粒尺寸]
图 O: 粒径和机械分离能力 [相同色谱柱长度]
化学分离能力 - 选择性
选择一种颗粒化学[固定相]和流动相的组合－－分离系统－－将决定化学分离能力[我们改变每一种分析物的速度的方法]的程度。优化选择性是创造分离最强有力的方式，这样可避免对最高机械效率的无尽追求。要产生对任何两种化合物的分离，科学家需在多种条件的相组合[固定相和流动相]中和保留机制[色谱模式]中选择。
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