本文作者利用飞秒脉冲激光法制备了新型的“超亮Ag2S量子点”，实现了超低剂量注射下的动物活体再深层组织内的高分辨成像。
量子点作为一种半导体纳米粒子，其吸收和发射光谱随尺寸变化而变化，因此量子点在照明、显示器、激光器和生物荧光成像等领域都有着十分重要的作用。硫化银（Ag2S）作为典型的二元半导体，其带隙较窄（约1.1ev），在近红外区域具有荧光发射的性质，且由于其较低的毒性在近红外二区成像方面具有较好的应用前景。传统方法制备Ag2S量子点的量子产率低于1%，这是由于传统的Ag2S量子点表面与结构缺陷以及量子点与溶剂相互作用引起的非辐射途径增加，此外高温条件是制备传统Ag2S量子点所必需的，由于Ag离子具有较高的还原势能，从而不可避免地形成Ag纳米粒子，通过等离子体耦合使得Ag2S亮度降低，而较低的亮度会导致成像信噪比低，空间分辨率不高，为了解决这一问题，作者利用飞秒脉冲激光照射传统方法制备的Ag2S量子点的氯仿溶液，在飞秒时间尺度上发生Ag+与CHCl3溶质分子的超快光化学反应，产生的AgCl分子附着在Ag2S纳米粒子表面形成一层保护壳，减少了量子点的非辐射途径，使得新制备的Ag2S“超亮点”量子产率相较传统Ag2S量子点提升了80倍，PEG化后的“超亮点”可以生物安全级别的低激发功率激发（10mW/cm-2）和低剂量给药（＜0.5mg/Kg），从而在深层组织实现高分辨成像。
基于传统方法合成的Ag2S量子点，经过飞秒脉冲激光照射后，会发生肉眼可见的变化（图1a），这种变化体现在吸收光谱上是位于400-500nm波段处传统的Ag2S量子点有一个突出的肩峰（图1b），此系Ag纳米粒的等离子共振吸收，而“超亮点“无此吸收，这是因为经过飞秒脉冲激光处理后”超亮点“内的Ag纳米粒转化为AgCl保护壳。此外，作者还验证了飞秒脉冲激光的最优照射时长为50min（图1d&e），此外荧光寿命随着照射时间的变化与量子产率的变化趋势一致（图1f）。
图1：a）Ag2S量子点飞秒脉冲激光处理前（左）与处理后（右）的对比图；b）Ag2S量子点与Ag2S超亮点吸收光谱；c）飞秒脉冲激光（50fs，90min，9W cm-2）处理前（左）和处理后（右）在808nm连续波激光激发下的荧光成像对比图；d）飞秒脉冲激光不同照射时间下，Ag2S 的CHCl3溶液对应的NIR-II发射光谱。插图显示了808nm激光照射前后样品归一化后的发射光谱；e）飞秒脉冲激光不同照射时间下的量子产率（QY）的变化曲线；f）飞秒脉冲激光不同照射时间下的荧光寿命曲线。
为了探究此种现象的原因，作者分别研究了各种因素对实验产生的影响。作者从飞秒激光功率、溶剂、是否含Ag纳米粒以及不同脉冲时间等因素探讨了可能的机理。首先是脉冲激光（50fs）的功率要适中，过低的功率（3W/cm-2）无法引起光化学反应，而过高的功率（100W/cm-2）又会导致样品降解（图2a）。其次，在正己烷、水、氯仿和甲苯中，只有氯仿能引起量子产率增加的现象（图2b），如果Ag2S量子点不含有Ag纳米粒，也不会产生此现象（图2c），最后，脉冲间隔为50fs的条件下产生最优的结果。而持续照射的激光不引起任何变化甚至导致荧光减弱（图2d）。基于以上种种结果，作者给出了对产生这一现象可能的机理解释，如下图2e所示，当用808nm的飞秒脉冲激光照射时，Ag纳米粒子双光子吸收后会诱导产生高的自由电子密度，从而引起Ag粒子的库仑爆炸，产生高反应活性的Ag+，并与CHCl3反应生成AgCl，附着在Ag2S上形成保护壳，低带隙的Ag2S（0.9ev）表面覆盖着的高带隙（5.13ev）无机化合物AgCl保护层可大大减少氯仿溶质分子振动活化的非辐射跃迁，并防止浅或深中间能隙态形成的可促进非辐射去激发途径的表面陷阱，从而促进荧光量子产率激增。
图2：a）飞秒激光不同功率激发下的时间-荧光密度演化曲线（50fs）；b）不同溶剂条件下照射时间-荧光密度演化曲线；c）含有与不含Ag纳米粒子的时间-荧光密度演化曲线；d）50fs、100fs、200fs、500fs以及持续照射条件下的时间-荧光密度曲线；e）可能的机理解释示意图
随后作者进行了动物成像实验，作者首先在Ag2S表面修饰PEG链并和传统的Ag2S对比了荧光寿命（图3a），为了证明“超亮点“的优异发光性能，作者选取了单壁碳纳米管、稀土掺杂材料以及传统的Ag2S量子点进行了动物成像实验，如图3b所示，在任何激发功率条件下，”超亮点“的发光性能最优，凭借于此，其信噪比是所有实验组中最高的（图3c&d）。小鼠左后肢血管成像进一步证实了该材料的优异性能，如下图3f，两只小鼠左后肢分别注射传统Ag2S（左侧）和”超亮点“（右侧）后立即成像，15s后可以看到血管亮度有明显差异，通过扣除背景荧光获得净信号图像（图3g），同时除以背景信号值获得信噪比对比图（图3h），两者均显示出”超亮点“在提升信噪比方面具有更好的效果，对大隐动脉处的净信号（图3i）和信号-背景分布定量结果（图3j）也显示出相比于传统Ag2S量子点，作者开发的新型Ag2S量子点将净信号提升了60%，信噪比提升了90%。
图3：a）PEG化传统Ag2S量子点与“超亮点的近红外荧光衰减曲线；b）不同近红外荧光材料小鼠成像对比图；c）激光功率-信噪比曲线；d&e）不同功率下小鼠成像对比图和激光功率-信噪比曲线；f）两只小鼠静脉注射Ag2S点(左图)和”超亮点“(右图)前后15s的NIR-Ⅱ荧光图像；g）净信号图像（由图f中底部图像扣除图f中上方背景图像得到）；h）信噪比对比图(由图f中底部图像除以f中上方背景图像得到)；i）& j）分别为在图g和h中白色虚线所划的大隐动脉的净信号与信噪比对比图。
最后，作者对所开发的新型Ag2S量子点进行了生物安全性实验。作者对小鼠尾静脉注射了总量为0.5µg（~0.5mg/Kg）的Ag2S量子点，该剂量比传统Ag2S量子点的用量（6.6mg/Kg）少了一个数量级，这种成本节约型和低毒性的探针为未来的临床转化和应用打开了新的大门。小鼠全身成像后发现量子点大多数聚集在肝脏之中（图4a），此外脾脏和心脏也有少许摄取（图4b&c）,此外在小鼠的进食量、体重和体温方面，进行连续检测发现无明显变化（图4d&e&f）。生化指标方面，作者分别测量了谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、血清碱性磷酸酶(ALP)、肌酸酐和胆红素的第1和28天的含量变化，结果显示无明显指标改变，证明了作者所开发的新型Ag2S量子点在低剂量下的生物安全性。作者认为这是一个很有希望的结果，需要指出的是，新型Ag2S“超亮点“的临床转化需要进一步的毒性实验，包括研究最大耐受剂量、清除途径以及对生理、代谢、行为和认知的影响，这个过程将会是漫长的，但该研究结果可能为未来的临床转化奠定基础并为其他研究人员带来新的研究思路。
图4：a）注射“超亮点“后不同时间点的NIR-Ⅱ成像图；b）肝脏、脾脏、心脏和股动脉荧光强度-时间分布曲线；c）肝脏、脾脏、心脏与肺的NIR-Ⅱ与光学成像图；d）、e）和f）分别为对照组与实验组小鼠两周内进食量、体重和体温变化曲线；g）、h）、I）、j）和k）分别为实验组小鼠第1和28天的ALT、ALP、AST、肌酸酐和胆红素的含量变化。
参考文献
Santos H D A, Gutiérrez I Z, Shen Y, et al. Ultrafast photochemistry produces superbright short-wave infrared dots for low-dose in vivo imaging[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-12.
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