彗星试验原理及注意事项（二）

彗星试验试剂盒

北京汇智泰康针对碱性彗星试验开发彗星试验试剂盒，本试剂盒提供了彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）需要的主要试剂盒耗材，省去了细胞裂解液、细胞悬液、碱性电泳液、电溶胶配制等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测和多次试验验证，符合碱性彗星试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。

碱性彗星试剂盒应用广泛，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒性检测评价。

【产品说明】
  本试剂盒提供了单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis,SCGE）需要的试剂和耗材。
 

• 细胞裂解液避免了多成分配制的繁琐工艺，保证了每次实验细胞裂解的稳定性。

• 电泳胶经过采用先进工艺规模化制备，出厂前经过严格的质量检测，实验时直接溶解即可使用。

• 针对实验设计的两孔式玻片增加了溶胶的粘附性，使细胞完整，便于拍照分析。

【试剂盒应用范围】
本试剂盒应用范围非常广，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装 材料等遗传毒理学检测。

【传统试验操作不足】

• 溶液配制繁琐，每次配制裂解效果不同。

• 不同胶浓度会影响DNA尾百分数，过低浓度的胶稳定性差，过高浓度的胶会抑制彗星尾的产生，且反复溶胶会导致储备液蒸发，影响试验结果。

• 传统玻片对溶胶的粘附性较低，且溶胶易流出玻片，损失较大。

【试剂盒优势】
便捷—— 本试剂盒省去了裂解液配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

【产品使用说明】

仪器和设备
干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、双稳定电泳仪、电泳槽、倒置荧光显微镜和低速冷冻离心机等。

试剂配制
实验开始前，请根据说明书要求自行准备实验所需试剂及耗材。 
  

注：可根据实验实际需求改变试剂的配制量。

单细胞悬液制备
（1）悬浮细胞：细胞悬浮液经离心分离获得。将细胞以1×10⁵个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。
（2）贴壁细胞：轻轻从皿底分离细胞。将细胞和培养基转移到离心管中，进行细胞计数。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。将细胞以1×10⁵个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。
（3）组织制备：称取组织约0.05 g，加入制备缓冲液（含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS）立即剪碎，冲洗。迅速研磨组织，过滤，整个过程在冰上操作。离心重悬，计数单细胞悬液密度约在为1×10⁵～4×10⁵个/mL。

制片、裂解、解旋及电泳
（1）取120μL浓度为电泳胶A趁热铺于磨砂载玻片上，形成底胶，用盖玻片推匀，不能有气泡，4℃凝固20min。
（2）水平取下盖片，取80 μL电泳胶B与20μl细胞悬液混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃凝固5min，形成第二层胶。再取80μL电泳胶B铺在第二层胶上，4℃凝固5min，形成第三层胶。保证细胞均匀分布于每孔，每个样本平行2孔。
（3）细胞裂解
将玻片置于平皿中，加入预冷的裂解液（裂解液：DMSO=10:1），4℃过夜裂解，裂解液平面刚好没过玻片表面。裂解后，倒掉裂解液，用超纯水清洗3次，5min/次。
4、解旋
加入预冷的解旋液（pH＞13）没过玻片，4℃避光解旋1h。
5、电泳
预先将电泳槽置于冰盒内，冷却备用。将解璇后的细胞玻片置于电泳槽，倒入电泳液，调整电压 22-24V，电流约为300Ma，电泳20min。电泳结束后，取出玻片，轻轻擦拭，去除多余液体。
超纯水清洗2遍，无水乙醇脱水1遍，5min/次。37℃烘干。

染色、拍照及分析
染色时将稀释过的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000，加到玻片每孔表面，每孔100μL，避光染色30分钟。超纯水清洗3遍，去除多余液体，37℃烘干或室温避光晾干。
拍照前关闭实验室光源，使用CASP1.2.3beta2彗星图像分析软件进行分析，每只动物都要分析150个可分析的尾DNA含量百分率的中位数。分析过程中如遇刺猬细胞进行标记。
 
【注意事项】
1.本试剂盒仅供科研使用，不可用于诊断程序。
2.实验开始前，请自行准备DMSO、超纯水、手术器械、筛网、无水乙醇、染色液、水平电泳槽等。
3.使用组织进行彗星试验时，需注意细胞制备需全程在冰上进行，且保证在1 h内完成铺片。
4.电泳胶使用时需提前水浴融化，禁用微波。
5.因各实验室条件不同，各种激发光源所需染色液各异，本试剂盒未提供染色液。推荐的染色液包括但不局限于Gene Red、SYBR Green、SYBR Gold等。
6.清洗玻片时注意不要直接将液体倾倒至胶面，防止脱胶。

图1 阳性对照

图2 阴性对照

注：附图仅供参考，以实际为准。
 
常见问题及原因分析
1. 大鼠麻醉处死后，取肝脏样品制备要注意肝的保存温度及保存时间、冷冻组织以及一些其他诸如取样所用缓冲溶液、所取肝脏组织大小等因素。取好的肝脏在制成单细胞悬液前最多在冰上保存1h。一半彗星实验所取的肝脏大小约为0.05cm³。
2. 如需将组织冷冻，应将组织取出后迅速并深度冷冻，直至制备单细胞悬液时取出。
3. 解旋时间会影响DNA尾百分数，DNA尾百分数随着解旋时间的延长而增长。
4. 电泳时间会影响DNA尾百分数，细胞DNA迁移随着电泳时间的增长二增长。可以通过改变电压提高试验的灵敏度，推荐电压为0.7V/cm。