超连续谱光源在激光层照显微镜Lightsheet使用中的优势...

2021.2.23

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

超连续谱光源在激光层照显微镜Lightsheet使用中的优势及应用

在路易斯安那州新奥尔良的神经科学年度会议上，卡尔蔡司的显微镜事业部提出了一项新的显微技术，即激光层照显微镜(Lightsheet )。这给生物学家带来了在活体生物动态成像研究上的新方法。

▲Lightsheet观察的小鼠大脑

生命观察

生物学家可以使用新的显微系统观察整个生物体在几天甚至更长时间内的发育。极低的光毒性和整合的培养系统可以在不损伤样本的情况下观察细胞群的分化。在大型生物活体上，特别是像果蝇或斑马鱼胚胎，相比已有的荧光显微镜观察方式来说，激光层照显微镜(Lightsheet)可以提供更多的信息。

同时，激光层照显微镜也可被用于海洋，细胞生物学和植物生理学。它的光照光束(层照光束)只会照亮样本很薄的一层，因而起到保护样本其他部分的作用。并且它的成像光束与光照层成90度角。因此，激光层照显微镜能在最小的照明强度下获得最好的图像质量，尤其适合于活体样本的长期试验。成像从不同的观察角度获得数据，再通过数学运算进行三维重建和时间序列视频录制。

Lightsheet 激光层照系统使用了可实现柱面透镜光学与激光扫描相结合的新型光学概念。用户能从复杂的实验样本上得到均匀的光学切片信息。

▲Lightsheet观察的小鼠海马区

开创荧光显微技术新纪元

Lightsheet 是观察活体样品发育的一种对样品损伤低的方法，它开启了研究新纪元。以下为激光片层扫描显微技术（Light Sheet Fluorescence Microscopy）的应用：

一、形态发育和胚胎形成

在斑马鱼和黑腹果蝇等模式生物胚胎形成阶段，对细胞进行时间、空间模式的荧光成像。

二、器官发育与细胞动力学

胚胎与小型生物中细胞动态过程的快速成像，例如：细胞迁移、心脏发育、血流、血管发育、神经发育及钙成像。

三、三维细胞培养

三维细胞培养、球体和囊肿、组织培养、器官培养的实时成像。如细胞迁移、表达模式及细胞增殖的分析。

四、对光透样品成像

对荧光标记的固定样品（组织切片、小鼠大脑、胚胎、器官、球状体和活组织切片）成像，采用折射率 n=1.38 或 n= 1.45 的水性透明介质对样品进行光透处理。选用 Scale A2，n=1.38，（Hama 等，Nat Neurosci 期刊，2011 年）或 FocusClear™ （CelExplorer Labs 公司，http://www.celexplorer.com）澄清液，n=1.45（Chung 等，Nature 期刊，2013 年）处理最佳。

五、植物

观察敏感的发育过程和执行生理测量。

六、海洋生物成像

使用 Lightsheet对海洋生物进行荧光成像，例如：海鞘、鱿鱼、浮游生物及扁形虫。

七、荧光标记的活体样品的结构特性

固定和活体样品的精细三维结构成像，例如：斑马鱼和青鳉鱼。

激光器

目前Lightsheet显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下四种类型:

半导体激光器:405nm(近紫外谱线)

氩离子激光器:457nm、477nm、488nm、514nm(蓝绿光)

氦氖激光器:543nm(绿光-氦氖绿激光器)633nm (红光-氦氖红激光器)

UV激光器(紫外激光器):351 nm、364 nm(紫外光)

为了适应多种观测需求一般采用多激光系统，需要用到多个独立的激光器经过复杂的系统耦合到一起，系统复杂且成本高昂。现在NKT公司推出的超连续谱光源完美的解决了这个问题。

超连续谱光源的优势

超连续谱是指高功率的窄脉冲的入射光通过非线性介质时，由于自相位调制（SPM），交叉相位调制（XPM），受激拉曼散射（SRS）,和四波混频（FWM）等非线性效应与光纤群速度色散（GVD）的共同作用，出射光谱中产生许多新的频率成分，光谱宽度远远大于入射光脉冲的谱宽，频谱范围从可见光一直连续扩展到紫外和红外区域。