数字化病理系统中放大倍数与分辨率的关系

简介
 
毫无疑问，在可见的未来，数字化病理学是病理学的希望。如今许多病理实验室开始采用这一技术，应用到包括远程病理学（远程会诊）、定量图像分析和实验室工作流程的数字化。数字切片扫描系统是数字化病理的一个重要组成部分，它使以玻璃病理切片为基础的工作流程转变为数字工作流程。随着越来越多的病理实验室采用数字病理，经常问的一个关键问题是“为什么图像大小与我的显微镜不一样？例如当用传统光学显微镜的20x物镜观察玻璃切片，然后用相同20x物镜扫描的数字图像来观看时，所感知到的图像大小可能不相同。
 
许多病理医生第一次用数字切片时惊讶地发现，用同一个物镜获得的图像，常规光学显微镜上的与数字显示器相比，比例相差如此之大，这是所有数字病理成像系统中常见的现象。出现这种情况的原因是，全切片图像（WSI）的大小取决于（1）扫描仪使用的物镜放大倍数，（2）数码相机传感器内单个像素的大小和数量，（3）显示器单个像素的大小和数量。图1所示的图像说明了这一点。
 
图1：使用相似的×20物镜显示阑尾中的蛲虫图像，但传感器像素大小不同。
 
图1显示了在两个不同的WSI扫描系统的图像。两台扫描仪都使用一个×20物镜来获取数字图像。a的图像来自扫描仪厂商1，由5.5微米像素传感器拍摄，b的图像来自扫描仪厂商2，使用10微米像素大小的传感器拍摄。显示在屏幕上，a比b图像大1.7倍，来自厂商1的扫描仪图像由于其像素分辨率高而包含更多信息。当以全数字分辨率观看时，保持物镜恒定并改变传感器中的像素大小将产生不同感知尺寸的图像。依WSI系统中的数码相机和物镜的数值孔径（NA）的不同，图像的数字分辨率可能会有很大的不同。
 
放大率不是分辨率，光学分辨率不是数字分辨率
 
另一个重要的考虑因素是放大率和分辨率之间的区别。在理解这一点之前，我们必须了解数字分辨率和光学分辨率之间的区别。本质上，所有的分辨率定义都是描述两个物体在图像中可以被区分的最小距离。例如，使用一个观察系统，如果两个物体在“模糊”在一起并显示为一个物体之前，两个物体之间的最小距离为1微米，则分辨率为1微米，即系统可以分辨相距1微米的两个物体。对于没有传感器的纯光学系统，分辨率取决于光和玻璃光学系统的相互作用，这在显微镜中通常被描述为瑞利（Rayleigh）分辨率极限（R）。其计算：
R=0.61λ / NA
如果我们知道光的颜色（绿光的λ约为0.53微米）和玻璃光学元件的性质(数值孔径即NA), 数值孔径表征物镜的聚光能力,是物镜的重要性质之一。理论上NA=nsinθ，因此增大物镜的数值孔径（NA）有两个途径：
:⑴ 增大透镜的直径或减小物镜的焦距即设计短焦距的物镜,以增大孔径半角θ。但此法会导
致像差增加及制造困难,一般不采用。实际上sinθ的最大值只能达到0.95。
⑵ 增大物镜与观察物之间的折射率n。干系物镜是以空气为介质的,折射率n=1,一般用于低倍物镜。油系物镜常以松柏油(n=1.515,NA=1.4)，图2显示这样关系：
   
图2：不同数值孔径的物镜具备不同的分辨率
 
因此，我们看到基于光学，光圈大小和光的波长都很重要，但这种放大并不直接转化为解析力或分辨率。因为我们需要更高的分辨率时，会使用更高NA值的物镜，而通常该物镜也具有更高的放大倍数，改变NA和放大倍数经常同时发生，所以放大倍数与分辨率或解析力往往让人混淆和困惑。例如，从0.5NA物镜的×20转换为0.9NA的×40物镜时，最小分辨率从0.64微米提升到0.36微米（对于绿光）。对于0.9NA物镜，与0.5NA物镜相比，得到了更高的分辨率，真正的分辨率提高来自于NA的增加，而不是放大倍数的增加。
 
当涉及到数码相机传感器和显示器器时，分辨率不再仅仅由光学镜头决定。这是因为像素的大小和像素的数量也决定了两个物体是否会作为单独或分开的物体显示出来。使用上述例子，如果两个物体在投射到传感器上时相距1微米（被物镜“放大”后），像素大小为10微米，则这两个物体很可能看起来是一个。这意味着传感器无法解析1微米大小的图像特征[图。在本例中，传感器需要0.5微米的像素大小，以确保两个物体显示为两个不同的物体， 而不是融合在一起不能分辨。根据Nyquist公式，像素大小（P）有以下公式表达：
P=R /2=0.3λ/NA
光学分辨率仅取决于物镜和光的颜色，而数字分辨率则取决于物镜、数码相机传感器和显示器，并且在整体系统性能方面三者密切交织在一起。物镜必须具有“看到”感兴趣特征所需的光学分辨率；数字分辨率无法弥补物镜的不足。然而，如果传感器的数字分辨率不够好，传感器可能会使玻璃物镜的优势丧失。
 
放大的作用
 
放大是指物体表面尺寸的变化，使物体更容易被看见。在用于病理学的传统光学显微镜中，使用一系列放大倍数的物镜，以确保通过肉眼观察到的图像足够大，便于观察。在这种情况下，放大不一定用来提高分辨率，而是用来使观看更容易。在WSI系统中，随着数码相机传感器和显示器的引入，放大倍数起到了匹配数码分辨率和光学分辨率的作用。在前面的例子中，我们不能用10微米分辨率的传感器看到1微米大小的物体，除非我们将图像放大20倍。一旦传感器以良好的保真度将图像数字化，就不再需要额外的放大，图像是否大小合适且易于查看现在取决于显示器了。数字显示器上的图像可能与传统的光学显微镜图像有很大不同，不再是病理医生平时熟悉的常规光学显微镜视野图像，病理医生需要尽快熟悉新的数字环境。
 
图3：显示工作站显示器器增加的放大倍数的图形
 
传统的显微镜提供了一对10x的目镜供观察，从而在观察切片时提供了额外的放大倍数。类似地，在显示器上显示数字图像可以额外放大倍数[图-即数字放大。前面10微米像素的例子中，当这个像素值移动到一个典型的工作站显示器上时，它通常会显示为270微米的像素，意味着数字放大倍数为27x，比以前用肉眼镜检所达到的放大倍数还要高。如果我们用一个更常用的传感器（例如像素尺寸6.45微米）），放大系数变为~42x，因此，如果不考虑物镜的放大倍数，很明显，图像的大小比例肯定会有所不同，取决于所使用的传感器。计算机屏幕上图像的放大率还受观看图像的人离显示器屏幕远近，你坐得越远，图像看起来越小。
 

 
总结
 
数字病理成像系统的图像放大是一个复杂问题。数字病理图像查看与传统显微镜检查之间存在差异，是必然的，可能导致供应商和病理医生之间的相互不了解。最重要的是WSI不同于传统的显微镜，它有额外的传感器和显示器。传统的光学显微镜图像质量名称可能不再适用于数字WSI；与其使用“40x”，更可取和科学的做法是使用可在不同系统之间进行比较的标准来表示图像质量，微米/像素将可能被更广泛和更恰当地用于表示数字图像中的特征。微米/像素是比“放大率”更好的、独立于各个生产商的指标，应被视为未来数字病理系统的标准。市场上各种数字病理系统之间的分辨率可能不同，微米/像素的显示可以帮助计算机辅助诊断（CAD）结果标准化，因为它显示分辨率。提供较低微米/像素值的WSI扫描仪让病理医生从图像中获取更多信息，病理医生可能提供更快的诊断，因为更少的读片时间，节省大量的时间。