细胞转染技巧及常见问题分析

1. Freestyle™ 293-F细胞的培养：在37℃，125rpm，8% CO₂的摇床培养箱中培养；转染当天Freestyle™ 293-F细胞密度达到1.5-2.5×10⁶个/ml时可以进行转染，但细胞存活率需>95%；可以使用生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(C0011)进行细胞存活率检测。
2. 以50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞为例，取两个洁净无菌离心管，分别加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F细胞培养液；然后其中一管加入50μg质粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™转染试剂，分别用移液器轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo293F™转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15分钟(室温存放6小时内稳定)。

3. 把2.5ml Lipo293F™转染试剂-DNA混合物全部加入到50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞中。由于青霉素/链霉素双抗可能影响重组蛋白的表达，通常不建议在细胞转染时加入双抗；如细胞培养环境容易发生污染，可酌情加入1/5常规用量的双抗。
4. Freestyle™ 293-F细胞在37℃，125rpm，8% CO₂的摇床培养箱中继续培养48-72小时后，即可收集细胞进行目的蛋白的检测和纯化。

常见问题：
1. 转染效率低：
a. 优化质粒与Lipo293F™转染试剂比例，有必要是可以适当尝试加大质粒用量。
b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A₂₆₀/A₂₈₀比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用生产的质粒大量抽提试剂盒(D0026)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
c. 需用无抗生素和无血清培养液配制Lipo293F™转染试剂和质粒的混合物。
d. 转染后培养时间不足，而被误认为转染效率偏低。悬浮状态下的Freestyle™ 293-F细胞转染后至显著表达所需培养时间通常为48-72小时。
e. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。
f. 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。
g. 检查转染时细胞密度是否过高。
2. 细胞毒性较明显：
a. 目的基因的表达蛋白有毒性。此时可以和空载体转染效果比较，以确定是否是目的基因蛋白表达对细胞产生毒性。如果确定有细胞毒性，可以考虑适当减少质粒用量，并按照比例减少Lipo293F™转染试剂。
b. 检查转染时细胞密度是否太低。
c. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。

附录：
常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.
  **These wells or dishes are square.