一、蛋白质浓度测定
可见光吸收法
1.1 Lowry法
1.2 考马斯亮蓝法(Bradford)
1.3 BCA法
方法
灵敏度
原理
应用
检测波长
改良的Lowry法
灵敏度高
TCA沉淀后的蛋白定量
750nm
考马斯亮蓝法
灵敏度高
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其最大吸收峰由465nm变为595nm,改良法降低了不同蛋白质与染料结合后的颜色差异
蛋白质快速定量(可耐受大多数的还原剂如BME、DTT等)
595nm
BCA法
灵敏度高
在碱性溶液中,蛋白质将二价铜(CU2+)还原成一价铜(CU+)后者与测定试剂中BCA(金鸡宁)生成一个在562nm处具有最大光吸收的紫色复合物
蛋白质定量,尤其是膜蛋白定量(可耐受大多数的变性剂如SDS,TritionX-100等;不能耐受还原剂如DTT,BME,葡萄糖,抗坏血酸等)
562nm
二、细胞增殖及细胞毒性检测
可见光吸收法
2.1 终点法
工作原理:
2.1.1 死细胞计数
--染料法:
细胞死亡后,细胞膜通透性增高,染料可以透过。
染料:台盼蓝,Cytorecon,PI等。
--比色法:
细胞死亡后,胞内物质释放,可在培养基中检出。
检测对象:51Cr,LDH等
2.1.2 活细胞计数
--染料法:
活细胞的线粒体酶可以还原染料,产生有色产物。
染料:四氮唑盐类(MTT,XTT,WST-1,CCK8/WST-8)等
检测波长:450nm(XTT,WST-1,CCK8/WST-8),490nm或570nm(MTT)
参比波长:690nm
2.2 动力学法
2.2.1 动态监测细胞增殖和细胞毒性)
工作原理:
--细胞增殖过程中,细胞体内的环境由氧化环境变化成还原环境,呼吸链中的NADPH/NADP,
FADH/FAD,FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高。
--AlamarBlue被细胞内吞后,在细胞质中被上述代谢中间体还原,最后释放到胞外。
--被还原AlamarBlue的积累使培养基从无荧光的靛青蓝转变成有荧光的粉红色。
检测波长:570nm
参比波长:600nm
三、细胞凋亡检测检测
工作原理:
--细胞凋亡的发生是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180~200bp或其数倍的
核小体片段,而核小体由于与组蛋白形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。
--应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶
解物中的核小体片段。
检测方法:
--在微定量板上吸附抗组蛋白抗体,加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液,核小体上
的组蛋白与包被的抗组蛋白抗体结合;
--加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体,与核小体上的DNA结合;
--加酶的底物,测光吸收值。
检测波长:405nm和492nm
四、报告基因检测
五、信号转导检测
六、活性小分子检测
七、内毒素检测
八、过敏原检测
九、其他酶类检测
文章链接:中国仪器批发网 http://info.china17pf.com/newsdetail/2663.html