数字PCR

先进的数字PCR技术实现了样品中的单分子核酸扩增，从而使的DNA定量的精准度提高到了全新水平。Philip与Stilla Technologies的首席执行官兼联合创始人Rémi Dangla进行了交流，讨论了数字PCR技术领域的进展和挑战。

Stilla Technologies公司总部位于法国巴黎，成立于2013年，生产和销售高精准度的DNA定量和检测的数字PCR系统。

“当我创立公司时，从未做过PCR，”Dangla说。 “但我了解了数字PCR技术之后，马上就被这个设计巧妙的技术所吸引。”

与之前的PCR技术相比，数字PCR是可以显著提高DNA定量的精准度的一种新技术。

“数字PCR技术为PCR技术在检测稀有突变或低浓度靶标基因方面的应用，赋予了无与伦比的数据可靠性”Dangla说。

数字PCR反应，不是传统式的混好PCR mix后直接扩增，而是将样品被分散到数万个微小的液滴后，进行PCR反应。科学家们设计特异性的探针，只识别与序列相对应的靶标基因，产生荧光信号，数字PCR系统自动数出含有阳性信号的微滴。

“这样的技术可以从100,000个野生型DNA分子中检测出一个突变分子，甚至是突变体只发生单碱基改变，也能被检测到。在使用之前的PCR技术进行这种实验分析时，得到的结果是错误的。”Dangla说。

实际上很早就有人提出了数字PCR的想法，“文献可追溯到90年代初”Dangla说。

当时的困难在于如何实现同时分析这么小的体积、且数量这么多的微滴。Dangla找到了解决这个困难的方法，将微流控技术和芯片技术结合，最大程度的简化了微滴的生成和分析。

Dangla认为数字PCR技术最具潜力的应用之一是只需少量血液样品即可进行癌症诊断，也就是液体活检技术。

“在尝试使用血液样本，进行血液样本中的ctDNA检测时，就类似大海捞针，”他解释道。 “数字PCR技术是唯一可以检测血液中的ctDNA分子并获得可靠结果的解决方案。”

例如，数字PCR特别有助于检测癌细胞对治疗中产生耐药性的突变，从而指导医生用药，更换治疗效果更好的其他药物。

数字PCR技术的潜在应用方向吸引了许多参与者进入日益增长的数字PCR市场，从2011年到现在增长数百万欧元。最早是Fluidigm公司，它于2006年发布了第一款产品，Bio-Rad现在以更低的价格占有最大市场份额。 Stilla Technologies公司的目标是实现市场上最简单，最快速的数字PCR技术，目前在这一领域已占有重要位置。

但仍然需要克服一些挑战，其中之一就是定价。 Dangla说数字PCR不可能完全取代前几代PCR技术。到目前为止，数字PCR价格偏贵，仅被用于更具意义的应用中。

随着技术的发展，成本问题即可解决，Dangla认为在精准DNA定量方便有个重要的但是被忽视了就是样品制备。本质上讲，就是数字分析前的DNA提取步骤。

“我们现在知道有关患者的所有信息都存在于含有一些稀有的生物标记物的10mL血液中。 现在的困难不是在分析系统中找到这些生物标记物;  DNA分子在芯片中，那就会被找到，会被检测到”Dangla说。

“困难在于如何在10mL中提取到DNA分子，并确保在20μL体系中能够检测和分析到。 这是一个取样问题。“

随着上个月的首次融资活动结束，Stilla正在考虑扩大其数字PCR系统的销售，并将开展Naica数字PCR系统在临床的应用，首先将从实现癌症患者液体活检样本的分析开始。

除肿瘤领域的应用外，数字PCR还应用在很多其它领域中，如转基因检测，制药公司的质量控制、伴随诊断等。随着数字PCR技术变得越来越精确，和成本的降低，这项DNA定量的新生技术将会越来越广泛。