细胞治疗中的细胞计数国际标准（二）

实验设计（DOE）在优化细胞计数流程中的应用

一旦细胞计数的目的和大致方法已经确定，建议使用“实验设计（Design of Experiments ，DOE）来进行方法优化和稳健性测试。

专家指出很多因素影响了细胞计数实验。这些因素包括准备细胞样品时使用的稀释液。稀释液可能影响样品的稳定性，引入或者减少影响计数的碎片或杂质。仪器与仪器之间的差异也是一个挑战，需要使用更稳健的体积校准策略来改进，例如使用已知浓度的微珠或其他体积校准方法。很多因素会影响细胞计数方法，精心设计的DOE有助于理解每个因素的作用以及各个因素在细胞计数过程中的联系。

细胞计数验证

基于现有的经验，很多参会者推荐了国际人类用药物技术要求协调理事会（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于细胞计数方法验证。ICH传统上专注于药物制造，而不是细胞治疗产品。指南中描述了准确度、精密度、特异性、检测限、定量限、线性、范围和稳健性的概念。这个通用的验证框架在很大程度上适用于细胞的分析测量，但对于细胞治疗产品要做出一些针对性的调整。

受限于动态、复杂，有时数量还有限的样品，需要对验证步骤进行改变，或者增加额外的考量。例如在考察细胞计数中间精密度（不同操作者、不同仪器、不同日期、不同批次之间的差异）时，实验设计时需要考虑整个周期中样品的稳定性，尤其需要考虑可能影响细胞计数的样品性质（如细胞活率、细胞聚集、碎片和气泡形成等）。

准确度对细胞计数来说，是个独特的挑战。理想的细胞计数计数结果应该既精密又准确。细胞计数的精密度可以通过实验确定。但因为缺少合适的参考样品和对照方法，细胞计数的准确度很难获得。

评估准确度一般是通过对比测定结果与具有参考值和已知不确定性的恰当参考样品的检测结果，或者通过与对照方法进行比较。因为细胞计数测定缺少通用的参考样品，基于人工显微镜观察计数的“金标准”也具有很大的偏差和不精密性，通过上述方法检测准确度不能满足细胞治疗产品对准确度的要求。

为了满足工业界的需要，NIST近期开发出了在没有合适对照方法和样品的情况下，评估细胞计数方法的策略。这些方法通过系列稀释试验设计，评估了细胞计数方法的精密度和比例性。在这样的实验设计中，细胞计数结果对梯度稀释的比例响应作为评价计数质量的内部基准【2】。这个过程不受测定方法和细胞类型的影响，提供了一种不依赖于“金标准”方法或参考样品比较，就可以评估细胞计数方法质量的途径。这个策略的目标就是解决细胞治疗产品生产者在细胞计数方法转型或者选择“fit for purpose”计数方法时遇到的挑战。

细胞计数的生物或非生物参考样品及内参

合适的参考样品将极大的有助于对细胞计数准确度的评估，有利于对细胞计数方法之间进行比较。因此，研讨会讨论中很重要的一部分就集中在现今细胞计数参考样品的使用和参考样品的需求上。会上达成了一个重要共识：使用者需要理解各种参考样品在计数过程中的作用。细胞治疗从业者需要优化的或者新的参考样品来评估细胞计数的准确度。会上讨论了生物的（基于细胞）和非生物的（主要是微珠）参考样品的作用。有人指出针对测定过程的特定方面需要选择合适的参考样品，且不应在其预期使用目的之外进行过度解读。

细胞计数计量保证策略

为了保证测量结果的质量，需要使用基于计量科学原则的计量保证策略。理想的测量结果由以下3点构成：（i）以常用单位表示的数值，（ii）测量不确定度，（iii）可以保证测量结果质量的证据。对细胞计数来说，了解测量过程是否会以及何时会达不到标准很重要。在这种情况下，需要设计计量保证策略以提供足够的证据来监测测量过程的质量，提供计数结果是否可靠的指示。测量保证的证据通常以测量过程中的中间测量形式出现，在整个测量过程中的特定点建立可信度。测量保证策略可以每年或每季度不定期实施，通过验证和SOP作为质量保证计划的一部分。仪器验证步骤等其他策略可以为每天的测量提供保证；或者与每次测量同时进行，以提供每个测量值的可信度。



当计量保证策略应用到每次测量中时，它们作为测量步骤中的控制环节，为测量过程提供同时验证。这种策略在长期记录和监测一种分析方法时非常有效，并能够识别方法中的偏移和错误。很多测量步骤中的控制环节可以直接使用细胞计数的数据，或者通过使用测试样品即可进行的简单实验来完成。这样的设计策略具有实际可操作性。例如，细胞计数结果是单位体积的细胞数；在使用细胞计数值做出决策之前我们有几个假设。这些假设包括：（i）细胞是悬浮于介质中的单个物体，（ii）所有目标细胞都被计数了，而其他的都被排除了，（iii）已知体积已经被验证过，（iv）试剂和仪器工作正常，（v）检测结果在线性范围内，在检出限以上，在饱和限以下。在测量时需要收集证明以上假设是可信的证据。例如，需要设置对照试验和数据分析策略，在试剂出现问题、细胞过度聚集、流路堵塞、仪器状态改变或预设体积错误时提醒使用者。当设置了合适的测量步骤中的控制环节，细胞计数测定过程的质量才能获得保证（图4）。

总结

本次细胞计数研讨会的一个关键结论就是：获得高质量细胞计数结果的方法并不是单一的。使用者必须要考虑细胞计数的目的，设计最合适的方法和计量保证策略。人们需要开发、鉴定和验证细胞计数方法的通用策略和原则，这些前期的努力会决定后期标准化的考虑和努力方向。关于细胞计数的建议包括：（i）文件标准和最佳实践指南，（ii）一致的术语，以实现共同理解和清晰的沟通，（iii）生物以及非生物参考样品以提升计量保证，（iv）有别于“one-size fits all”观念的，基于“fit-for-purpose”原则的个体化检测策略。

Nexcelom Bioscience 作为受邀细胞计数设备供应商之一参与了本次研讨会，与多位同行、细胞治疗从业者及政策法规制定者进行了广泛的交流和讨论，也更加深入地了解了行业所面临的挑战以及业界对相关设备制造商的期望。作为细胞计数领域的领导品牌，Nexcelom责无旁贷，会一如既往地以技术创新为驱动力，打造基于用户需求的产品，为细胞治疗产业和人类健康事业的发展贡献应有的力量！

参考文献

[1] ICH. Validation of analytical procedures: text and methodology. In: Secretariat I, editor. ICH HarmonisedTripartite Guideline. Geneva, Switzerland: ICH; 2005.
[2] Sarkar S, Lund SP, Vyzasatya R, Vanguri P, Elliott JT, Plant AL, et al. Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a dilution series experimental design. Cytotherapy 2017;19:1509–21.