4.一致性和可重复性高
荧光信号是仅取决于目标抗原的量的静态值,而许多变量影响通过膜曝光获得的化学发光信号。一些变量(例如,酶底物反应)难以控制导致不一致和不可重复的结果。 Schutz-geschwender等(2004)报道了荧光蛋白印迹实验重复的标准偏差远远小于化学发光检测。因此,为了确保您的免疫印迹结果的重复性和准确性。
5.信号持续时间长
荧光信号非常稳定。您可以将您的印迹存储在冰箱中,并在您准备好后再进行成像。相比之下,如果您正在进行化学发光的免疫印迹,您通常需要马上开始成像。这是为了避免酶活性降低。
传统WB和荧光WB的综合比较:
化学发光法WB | 荧光WB | |
信号源 | 酶促反应的间接信号(HRP酶标二抗+ECL显色) | 荧光基团的直接信号(FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗) |
信号持续时间 | 几分钟到几小时 | 几天到几周,避光保存得当可长达一年 |
灵敏度 | 高灵敏度,底物种类多样(DAB、ECL等) 例如ECL显色,HRP酶标二抗1:20000~1:50000 |
灵敏度较好 例如Dylight荧光二抗 1:10000左右 |
一致性 | 印迹间可能存在差异 | 印迹间的重复性较高 |
检测 | 胶片、化学发光法成像仪器 常见凝胶成像仪器均可 |
需有合适光源和滤光片的成像仪器,例如li-Cor、Bio-rad、天能等。 |
定量 | 定性及半定量,单通道检测使标准化较为困难 | 带有内部对照的多重分析技术使标准化较易实现 |
其他注意事项 | 相似分子量需要进行剥离和印迹的重新检测 曝光时间可以较长 |
需要注意避免荧光背景 由于少量的激发光会穿过滤光片,因此曝光时间更长会导致背景荧光较高 需要注意避光 |
话不多说,结果才是硬道理:
骨灰级传统WB玩家跑出来的条带应该也就左上角的水平了吧?相较于采用荧光WB随手一跑的结果(右上图和下图),如果你是审稿人,你会pick谁了?