Cytodex1和WAVE 25在高效无血清培养间充质干细胞的应用-2

二、实验步骤

1.

微载体的预处理

1.1 微载体处理：Cytodex 1 使用 DPBS 泡发 3 h。

1.2 使用 DPBS 洗涤 2 次 Cytodex 1，DPBS 浸泡后灭菌（121℃，30 min）。

1.3 Cytodex 1 冷却沉淀后，弃上清，安全柜内无血清培养基洗涤 2 次，定容。

2.

WAVE 的操作

2.1 无菌环境下拆开细胞袋，安装无菌空气滤器等配件。

2.2 将微载体培养液及细胞悬浮液依次从细胞袋输液管道输入。

2.3 将细胞袋固定在 WAVE 反应器托盘上，连接空气泵，设定温度 37 ± 0.5 度、泵压、反应器转速度和角度。

3.

MSC 细胞接种及培养过程

3.1 按 6000 cells/cm²接种新鲜 MSC 细胞至微载体培养液中（3 g/L）），孵育 30 min-1 h（间歇式摇匀）或者孵育过夜，调节转速至细胞不沉降聚集即可。

3.2 每隔一天从细胞袋无菌取样口用无菌注射器抽取 5 ml-10 ml 培养液进行镜检及支原体、内毒素等安全性质量检测。

3.3 培养 4-5 天，细胞长满。

4.

MSC细胞的收获

4.1 培养 4-5 天后将细胞微载体悬浮液从细胞袋出液管道输出至细胞收集瓶。

4.2 弃上清，DPBS 洗涤一遍，加入 Tryple 消化酶，温和摇匀消化 10 min-15 min。静置，待微载体沉降后，吸取细胞悬浮液。DPBS 再洗涤 2 遍，吸取细胞悬浮液。

4.3 离心 400×g，5 min。收集细胞，计数。

三、实验结果

1.

细胞生长情况

按0.6 × 10⁴ cells/cm2接种新鲜MSC细胞至微载体培养液中（3g/L），4-5天后细胞可以长满Cytodex 1，每cm2可以生长2.5 × 104 MSC，细胞在Cytodex 1上的生长照片如下图1。

图 1. 微载体培养 MSC 生长图片

2.

流式细胞仪检测MSC细胞表面标记物

药典对 MSC 细胞表面标记物的检测要求是：CD73、CD90、CD105 ≥ 95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR ≤ 2%。对上述培养的细胞进行检测，结果显示细胞表面标记物均满足要求并且阳性指标 CD73、CD90、CD105 、CD44 ≥ 98%，阴性指标 CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 总和≤ 2%（数据未显示）。

图2. 微载体培养MSC流式表型

3.

MSC 成脂和成骨分化

对 MSC 进行成脂和成骨诱导分化，油红 O 染色后显示成脂效果很好；茜素红 S 染色显示成骨效果很好。

图3. 微载体培养MSC成脂分化

图4. 微载体培养MSC成骨分化

四、成本分析

以培养单人次回输细胞量 3.2×109 cells 为例，对比新型和传统扩增 MSC 方式的成本分析，主要从培养阶段的耗材成本和人员成本角度考虑，其中耗材成本如下图 5，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培养方式相较于 150 mm Dish 能够节约 14%，相较于 Hyper  Flask 能够节约 190% 的耗材成本。人员成本角度列于表 1，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培养方式可以减少培养批次，从而降低批次间变异性，同时拥有合理的人员成本。

图5.不同培养方式耗材成本分析

表1.不同培养方式人员成本分析及批次数

总结

综上，采用微载体 Cytodex 1 和波浪式反应器 WAVE 可以高效培养间充质干细胞，能够得到满足药典需求的细胞表面标记物，以及很好的进行成脂和成骨分化，同时具有较低的耗材消耗成本以及最少的批次数，降低批次间的变异性，便于对过程进行监控。

以上实验数据来自于原能细胞科技集团，原能细胞科技集团是创业板上市公司开能健康（300272）投资创建的企业，开能健康持有原能集团近 16% 的股份，是单一最大股东。