如何检测蛋白是否泛素化？

       继上周整理的泛素化蛋白快速富集纯化的解决方案后，最近又有客户问“我想在体外检测组织中的一个蛋白是否在处理因素作用后发生泛素化，请问有这方面的实验方法吗，或者试剂盒吗？”作为泛素研究领域的专家，LifeSensors可为您提供全面的泛素研究解决方案，如何鉴定靶蛋白是否发生泛素化修饰？你问了，我安排！

       如何判断蛋白是否泛素化? 是哪种类型的泛素化修饰？ UbiTest可以给您答案。

       UbiTest检测原理：先通过TUBEs富集纯化样本中的泛素化总蛋白，随后，将分离到的泛素化蛋白经或者不经去泛素化酶DUBs处理，（+）/（-）DUBs处理的蛋白样本用靶蛋白的特异性抗体进行免疫印迹（WB）分析，通过条带比对分析实现对泛素化蛋白的定性及半定量检测。

       实例分析==＞

       样本：Jurkat细胞裂解液

       实验目的：MDM2和TNF-R1蛋白是否泛素化

       实验流程：通过TUBEs富集纯化样本中的泛素化总蛋白，经去泛素化酶DUBs处理，后，用靶蛋白的特异性抗体进行WB检测

       检测抗体：MDM2抗体

       Lane 1: 富集纯化的蛋白样本不经DUBs处理

       Lane 2: 富集纯化的蛋白经广谱型的DUBs处理（可以去除所有类型的多聚泛素链）

       Lane 3: 富集纯化的蛋白经特异性针对K48-泛素链的去泛素化酶处理（只能水解K48-泛素链）

       结果：Lane 2的条带信号（~55kda）与Lane 1相比明显增强，说明MDM2被泛素化修饰了

       Lane 3的条带信号（~55kda）与Lane 1相比有所增加，但是比Lane 2的信号明显减弱，说明特异性针对K48-泛素链的去泛素化酶并没有水解掉靶蛋白近端的泛素，或者说MDM2还存在其他连接类型的多聚泛素链。

       检测抗体：TNF-R1抗体

       Lane 1: 富集纯化的蛋白样本不经DUBs处理

       Lane 2: 富集纯化的蛋白经广谱型的DUBs处理（可以去除所有类型的多聚泛素链）

       Lane 3: 富集纯化的蛋白经特异性针对K63-泛素链的去泛素化酶处理（只能水解K63-泛素链）

       结果：Lane 2的条带信号（~50kda）与Lane 1相比明显增强，说明TNF-R1被泛素化修饰了

       Lane 3的条带信号（~140kda）与Lane 1相比明显减弱，Lane 3的条带信号（~50kda）与Lane 1相比有所增强，说明TNF-R1的泛素化类型为K63，但是还存在其他类型的泛素化修饰，所以比Lane 2的信号弱很多。