VISQUE用于标记和示踪T细胞的多功能树状纳米金颗粒的应用

【VIS QUE应用案例】1.一种用于标记和示踪T细胞的多功能树状纳米金颗粒
 
编辑：Bio times tech-Leo
 
在肿瘤的治疗方法中，免疫治疗已发展成为继手术、放疗和化疗之后的第四大治疗手段，越来越多受到学者的关注。一种基于T细胞的细胞免疫疗法(ACT) 是成为了其中的热点，主要方法是将体外分离并修饰改造、扩增后的患者自身的T细胞后回输患者体内，以激发自身免疫系统产生对肿瘤的杀伤能力。然而，在评估该疗法的效果评价过程中，怎样对T细胞及其功能进行活体实时监测示踪仍是一大技术难题。可用于监测和追踪T细胞的纳米系统为活体评价T细胞免疫治疗的功能和疗效提供了重要依据。为此， 东华大学史向阳团队设计了一种高效的纳米探针， 可利用聚胺胺(PAM AM)树枝状大分子包埋的金纳米粒子(Au-DE NPs) 与Fluo-4结合并用于计算机断层扫描(CT)和荧光成像双模态成像。
 

本研究采用端羟基聚乙二醇(PEG) 对PAM AM第5代(G 5) 树枝状大分子进行改性， 然后在树枝状大分子表面截留2.0nmAu纳米粒子， 并对多余的胺基进行乙酰化反应。随后， 将钙离子探针通过PEG羟基端基共价连接到树枝状大分子纳米杂化体上， 得到功能性的((Au 0) 25G 5.NHAc-(PEG) 14-(Fluo-4) 2) 纳米探针。该纳米探针具有良好的水溶性、高的X射线衰减系数、在一定浓度范围内良好的细胞相容性以及高的T细胞标记效率。共聚焦显微镜和流式细胞术结果表明，纳米探针能够对活化的T细胞进行荧光检测。此外，该纳米探针还可以实现活体皮下注射T细胞后的CT和荧光成像。因此，开发出的新型树状大分子纳米系统对促进和改善T细胞免疫治疗的临床应用具有重要的前景。

作者首先合成[(Au 0) 25-G 5.NHAc-(PEG) 14-(Fluo-4) 2) DE NPs纳米探针， 并分析了其紫外可见光谱以及488nm激发后的发射光光谱， 并得到了该纳米探针的CT和TEM图像。

Figure 1.((AuD) 25-G 5.NHAc-(PEG) 14-(Fluo-4) 2) DE NPs纳米探针的合成方式

Figure 2.(a) Free Fluo-4， Fluo 4， AM， 以及DE NPs((Auo) 2s-G 5.NHAc-(PEG·OH) 14和(Auo) 25-G 5.NHAc-(PEG) i 4-[Fluo-4] z) 的紫外可见光谱图；        (b) Free Fluo-4， Fluo 4， AM.以及DE NPs(Auo) 25-G 5.NHAc·[PEG-OH] u 4) 和((Auo) 25·G 5.NHAc-(PEG) u 4(Fluo-4) z) 在488nm的激发光激发后的发射光谱。


Figure 3.(a) ((AunJ25G 5.NHAc-(PEG] uw-(Fluo 4) ) DE NPs的TEM图像和金核心尺寸分布立方图；       (b) ((Aum] as-G 5.NHA e-[PEG] u-(Flu a-4) ) DE NPs在不同金浓度下的CT图像和(c)CT值。

随后， 作者提取了T细胞并进行了鉴定和活化培养， 然后用不同浓度的([A us) 75-G 5.NHAc-(PEG] 14-(Fluo-4) ：) DE NPs对T细胞进行了处理.并用CCK-B分析了T细胞活性.最后用激光共聚焦成像技术和流式细胞技术分析了T细胞被激活后的荧光图像和荧光强度。

Figure 4.(a) 不同浓度的((Auo] 2s·G 5.NHAc-(PEG] i 4-(Fluo-4) DE NPs处理T细胞24小时后用CCK-8分析T细胞活性；(b) 不同浓度的((Auo] 25-G 5.NHAc·f PEG) is-(Fluo-4) 4)DE NPs处理T细胞4小时后细睢内的金含量。

Figure 5.(a) T细胞和((A un] ：-G 5.NHAc-(PEG) 1+-(Fluo-4) ：DE NPs解育后， 在不同时间点通过PM A/lono激活后的激光共聚焦图像; (b)和(c)分别显示了用流式细跑技术得到的荧光分布图和荧光强度

最后，通过皮下注射T细胞并进行活体CT/荧光双模态成像，验证了该纳米探针在活体层面监测T细胞的生物分布和功能的可能性。

Figure 6.使用T细胞标记探针((Au 0) 25-G 5.NHAc-(PEG) 14-(Fluo-4) 2) DE NPs后， 在小鼠背部皮注射0min和5min的活体成像结果。(a) 活体CT成像；(b)CT值：(c)活体荧光成像；(d)T细胞荧光强度

结论：该这种独特的树状化合物大分子构建的多功能纳米探针可用于活体标记和示踪T细胞，并通过CT/荧光双模态成懒进行体内实时生物分布示踪。该纳米探针具有相当高的细胞相容性，在一定的浓度范围内具有高的T细胞标记效率(84.6%).并可在体外荧光检测T细胞激活。因为特殊的X射线衰减的特性，设计的树状分子纳米探针可用于活体双模态成像检測。总的来说该研究为纳米探针的研究提供了强有力的支持，在在免疫治疗中监测和追踪T细胞具有不错的潜力。在未来的工作，作者将研究纳米探测器的实时T小鼠肿瘤模型的细胞监测能力。这样一个该系统为T细胞的迁移，生物分布，激活T细胞免疫治疗的潜在机制和疗效提供了重要的依据。

上述研究发表在了美国化学会期刊Bio macromolecules(DOI：10.1021/acs.biomac.0c00147)上。第一作者为东华大学化学化工与生物工程学院的硕士研究生陈玫秀，东华大学的史向阳教授和以色列巴伊兰大学的Rachel a Popov tzer教授为共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项项目、国家自然基金委、上海市科委等项目的资助。

论文链接：
https：//pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00147
 

文中的活体荧光成像部分使用了VIS QUE DIn vivo Smart-LF紧凑型小动物荧光&生物发光成像系统.Smart-LF系列的小动物荧光&生物发光成像系统是由全球领先的科研级CCD生产商――vie works.Inc公司设计并生产的第三代智能型小动物实时活体成像系统。该系统秉承了VIS QUE系列活体成像一贯的高分辨率，智能实时，高采集速度的强大优势，同时通过增强相机性能，大大增加了信号采集的灵敏度， 使得VIS QUE回In vivo Smart-LF紧凑型小动物荧光&生物发光成像系统在羁光信号成像的领域表现出色，受到了广大客户群体的一致认可，可广泛应用于各种需要荧光或者生物发光功能进行的活体内示踪研究等。

VIS QUER In vivo Smart-LF紧凑型小动物荧光&生物发光成像系统可广泛应用但不仅限于以下荧光和生物发光成像实验中：

1.使用生物发光成像功能追踪肿瘤转移过程；
2.使用荧光或生物发光对实体肿瘤进行成像；
3.评估脑血流，下肢血流，淋巴管等的结构和功能；
4.新药或者药物递送系统的药代动力学研究；
5.评估新药或者肿瘤治疗方案在关节炎，动脉粥祥硬化.自身免疫性疾病，血管生成等作用中的疗效。