HILIC模式下的色谱柱平衡操作

【ACE色谱柱】HILIC模式下的色谱柱平衡


摘要
 

   为了得到稳定及可重复的保留时间，在分析之前用流动相充分平衡HILIC柱，必须确保在固定相表面存在稳定的吸附水层。相似的，在执行一轮梯度洗脱运行后，色谱柱需要用梯度开始的条件重新平衡，形成稳定的吸附水层。
 

平衡
 

   在液相色谱中，为了得到稳定及可重复的保留时间，必须用流动相充分平衡色谱柱到稳定状态。在等度或者梯度模式下，色谱柱没有充分的时间平衡，是导致重复分离性差的常见原因。
 

等度洗脱
 

   反向色谱中，在分析之前，为了充分平衡色谱柱，应用至少十倍柱体积的流动相流过色谱柱。表1 显示通用液相色谱柱规格的近似柱体积。如果升高使用温度，必须延长平衡时间使色谱柱的温度达到稳定平衡。
 

表1.全多孔颗粒填装的常用液相色谱柱规格的近似柱内容积

HILIC模式下，色谱柱平衡时间可稍微延长。因为这样做可以在硅胶表面建立和维持一个稳定的水化层，那就可以得到稳定和可重复的保留时间。
 

HILIC平衡所需时间在不同固定相、流动相和分析物之间是多样化，往往具有高度的应用依赖性。应当注意的的是，当使用具有缓冲盐的流动相时，需要更长的平衡时间。为了获得的稳定的HILIC方法，因此建议在方法开发过程中进行柱平衡时间检查和记录，这样做有助于方法在未来具有可转移性。
 

图1. 一个新厂家厂家且未被使用过的色谱柱，要求实现达到稳定的保留时间的条件下，在等度洗脱中平衡所需的柱体积，蓝色代表反相，绿色代表HILIC模式

作为一个通则，新购买的色谱柱在第一次使用时推荐用60-80倍的柱体积溶液来达到完全平衡（图1）。举个例子100×4.6mm 的色谱柱，流速1.5mL/min，要求用42-56分钟达到首次平衡。一旦运行完全结束，色谱柱应根据提供的色谱柱质量检验上的指示进行清洗和储存。下一次运行，使用更短的平衡时间，用20倍柱体积就足够了（图2）。
 

图2. 为了第二次及后续分析达到平衡所需要的色谱柱体积数量。
 

色谱柱：ACE HILIC-A，100×3.0mm，流动相：乙腈：100mM甲酸胺=90:10（pH 4.7），流速：0.43 mL/min，温度25°C，检测器：UV 214 nm，样品：2 -脱氧鸟苷、对羟基苯甲酸、硫酸沙丁胺醇。

梯度洗脱
 

   相似的规定也应用于HILIC色谱法的梯度洗脱。一个新的色谱柱应该在第一次进样前至少用60-80倍的柱体积的流动相平衡。然后执行梯度分析，一般用10倍柱体积的梯度洗脱方法起始条件的流动相，就足以重新建立平衡同时获得稳定的保留时间（图3）。对于HILIC梯度洗脱法保留时间的重复性，梯度洗脱重新平衡时间相比于反相色谱通常更为关键。
 

   建议在方法开发过程中彻底评估重新平衡时间，然后准确记录在正式方法文件中，以确保将来使用该方法的可靠性。
 

   当在HILIC模式梯度洗脱中使用缓冲盐流动相，应当在整个梯度洗脱过程中保持恒定的缓冲盐强度。通过混合相同浓度的缓冲盐在两个溶剂中很容易实现。注意应避免在高浓度有机相中发生缓冲盐的沉淀。
 

图3. 在HILIC梯度洗脱方法中重复进样之间，应该用相对于20倍柱体积流过的时间来达到重新平衡。

色谱柱：ACE 5 HILIC-A，150×4.6mm，流速：1.5mL/min，温度25°C，检测器：254 nm，样品：茶碱、次黄嘌呤、醋丁洛尔，鸟嘌呤，胞嘧啶，胞苷

流动相：

A：940ml乙腈+（50ml 200mM甲酸胺+ 10ml水）  pH3.0

B：700ml乙腈+（50ml 200mM甲酸胺+ 250ml水 ） pH3.0        

结论
 

    相比于反相色谱，HILIC方法通常需要更长的平衡时间来获得可重现性的分析物保留时间。推荐在整个方法开发过程中一直评估平衡时间。通过在这个ACE知识卡片列出的指南概要指导下，使用ACE HILIC色谱柱可以开发出可靠的和可重复性的HILIC方法。