(一)抗体要求
将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。
(二)荧光素要求
异硫氰酸荧光素最常用
要求：
①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；
②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；
③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；
④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；
⑤标记方法简单、安全无毒；
⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
(三)抗体的荧光素标记
1.搅拌法：
适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但易引起较强的非特异性荧光染色。
2.透析法：
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。
(四)荧光素标记抗体的纯化
抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素。
纯化方法可采用透析法或层析分离法。
(五)荧光抗体的鉴定
1.荧光素与蛋白质的结合比率
荧光素与蛋白的过量结合是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。
荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(F/P)。比值越大，则抗体结合的荧光素越多，反之则结合越少。一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P=1.5为宜，用于活细胞染色F/P=2.4为宜。
2.抗体效价
可以采用双向免疫扩散试验测定，抗原含量为1g/L时，抗体效价>1:16者较为理想。
3.抗体特异性
①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光；
②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，荧光强度应受到明显抑制。
(六)荧光抗体的保存
真空干燥后可长期保存。
防止抗体失活和防止荧光淬灭。
小量分装，-20℃冻存可保存2～3年。
稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。
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