高耐庆大霉素肠球菌耐药性接合转移试验的方法探讨-1

肠球菌是医院感染的重要病原菌 [1] ，对多种抗菌药产生耐药性，而且耐药菌株不断增加，接合转移是导致肠球菌庆大霉素等耐药基因转移、耐药性播散的重要原因，深入研究接合转移试验有助于了解肠球菌耐药性的产生机理。我们研究了不同培养基和不同转移方法对肠球菌质粒转移试验结果的影响，并对接合前后菌株的耐药性进行了分析。

材料与方法

一、材料

1 ．菌株

(1) 供体菌 36 株高耐庆大霉素 (HLGR) 粪肠球菌， 15 株 HLGR 屎肠球菌， 1 株耐万古霉素 (VER) 粪肠球菌均来自北京友谊医院的临床标本，所有菌株利福平 MIC 值均小于 32 μ g ／ ml 。

(2) 受体菌 粪肠球菌 JH2-2 ( 由 Don B ． Clewell 赠送，利福平 MIC>50 μ g ／ ml ，对庆大霉素、链霉素、青霉素、万古霉素、氨苄西林、四环素、红霉素、氯霉素敏感 ) ；本实验室分离的金黄色葡萄球菌 S1106( 四环素 MIC128 μ g ／ m1) 、表皮葡萄球菌 S368( 利福平 MIC64 μ g ／ ml) 。

(3) 质控菌株 粪肠球菌 ATCC29212 、 ATCC51299 。

2 ．抗菌药 庆大霉素 (Gm) 、链霉素 (Sm) 、青霉素（ Pen ）、利福平 (Rif) 、万古霉素 (Van) 、氨苄西林 (Amp) 、四环素 (Tet) 、红霉素 (Ery) 、氯霉素 (Chl) 等标准品购自中国生物药品检定所。

3 ．培养基

(1) 普通肉汤 (NB) 牛肉粉 10g 、牛肉胨 10g 、 K 2 HPO 4 · 3H 2 O 0.58g 、 NaCl 5g ，加水至 1000ml ，高压灭菌备用。

(2) 心脑浸液粉 (BHI) 购自 BBL 公司。

4. BHI 选择培养基 Gm ／ Rif 选择培养基①： Gm500 μ g ／ ml ， Rif50 μ g ／ ml ； Gm ／ Rif 选择培养基②： Gm500 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ ml ； Gm ／ Tet 选择培养基： Gm500 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 选择培养基①： Van64 μ g ／ m1 ， Rif50 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 选择培养基②： Van64 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ m1 ； Van ／ Tet 选择培养基 ： Van64 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml 。

5. PCR 相关试剂购自赛百盛公司、天为时代公司。 PCR 仪为美国 Biotronic 公司 AG-9600 型扩增仪。

6 ． Vitek — AMs 全自动微生物系统 (bioMerieux Vitek ， Inc ． ) 。

二、方法

1 ．菌株鉴定及药敏试验全部试验菌株经 Vitek 全自动微生物系统鉴定，药敏试验按照 NCCLS 推荐 Kirby-Bauer 法进行，采用 2002 年 NCCLS 推荐琼脂稀释法，进行高耐庆大霉素 (MIC>500 μ g ／ m1) 、高耐链霉素 (MIC>2000 μ g ／ m1) 、耐万古霉素 (MIC>6 μ g ／ m1) 的确证，以及利福平的 MIC 测定。

2 ．质粒接合转移试验

(1) 肉汤接合法 按参考文献 [2] ，进行，将活化后的保存菌株用生理盐水调制浊度为麦氏管 0.5 号，取 5 μ l 菌液于 1m 1 中不同的液体培养基：普通肉汤 (NB) 、普通肉汤加马血清 (NBH) 、心脑浸液 (BHl) 、 BHI 加马血清 (NBH) 。 35 ℃ 培养 4h ，取供体菌及受体菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，加入到 2ml 相对应的液体培养基中， 35 ℃ 振荡培养 4h ，离心后取少量沉淀培养物转种于含抗菌药物的 BHI 选择培养基， 48h 观察结果，有菌落生长者即为接合转移成功。

(2) 滤膜接合法 按参考文献 [3] 进行，将活化后的保存菌株用生理盐水调制浊度为麦氏管 0.5 号，取 5 μ l 菌液于 lml 中液体培养基 35 ℃ 培养 4h ，取供体菌及受体菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，直接涂布于灭菌的无菌滤膜 ( 孔径 0.22 μ m) ，将滤膜置于 BHI 平板中， 35 ℃ 培养过夜，用 1mlBHI 肉汤冲洗滤膜，将冲洗液转种于 BHI 选择培养基， 48h 观察结果，有菌落生长者即为接合转移成功。

3 ．质粒 DNA 的提取：采用碱性裂解法 [4] ，裂解液 I 中不必加入溶菌酶，加入Ⅱ液后静置时间延长至 7 ～ 10min 。

4. PCR 法检测耐药基因 检测双功能酶基因 aac( 6' )-apb( 2 ” ) 的引物 [5] 为 5' -TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT — 3' 和 5' — CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT -3' 。 20 μ l PCR 反应体系，扩增条件：预变性 94 ℃ 5min ，变性 94 ℃ 30s ，退火 52 ℃ 30s ，延伸 72 ℃ 60s ， 30 个循环，分别以 ATCC51299 和 ATCC29212 作为阳性和阴性对照。

结 果

1 ．粪肠球菌标准菌株 ATCC51299 、 ATCC29212 质控结果见表 1 。

表 1 粪肠球菌标准菌株在 8 种抗生素培养基上的生长结果

注：“ + ”有菌落生长，“—”无生长。

2 ．质粒接合转移试验结果

(1)36 株粪场球菌耐药质粒液体接合转移和滤膜接合转移试验的结果见表 2 。

表 2 36 株粪肠球菌质粒接合转移结果

注：普通肉汤（ NB ）、普通内汤加马血清（ NBH ）、心脑浸液（ BHI ）、 BHI 加马血清（ BHIH ）

(2) 使用 BHI 肉汤作为培养反应介质， 15 株 HLCR 屎肠球菌中无一株将 HLGR 耐药性转移至 JH2 — 2 。但通过滤膜接合法，有 14 株转移成功。

(3) 使用 BHI 培养反应介质， VRE 肠球菌将对万古霉素耐药性转移至 JH2 — 2 。

(4) 肉汤接合法、滤膜接合法均未能将 HLGR 、 VRE 的耐药性从肠球菌属转移至金黄色葡萄球菌 S1106 、表皮葡萄球菌 S368 。

3 ． HLGR 粪肠球菌的供体菌与结合子药敏试验结果见表 3 ，表 4 。 36 株粪肠球菌均对 3 种以上抗菌药耐药， 36 ％ (13 ／ 36) 和 47 ％ (17 ／ 36) 的菌株对 4 种和 5 种以上抗菌药耐药。