乙型肝炎病毒大蛋白检测在拉米夫定抗病毒治疗中的应用研究

    目的
     通过检测拉米夫定治疗患者血清中的乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP），同时检测乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）载量，探讨拉米夫定治疗过程中HBV-LP与HBV-DNA的关系，观察乙型肝炎病毒大蛋白用于评估拉米夫定抗病毒治疗效果的应用效果。方法  采用酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法对HBV-LP进行检测；采用荧光定量PCR方法对HBV-DNA进行检测。
     
    结果
      抗病毒治疗有效的患者HBV-DNA和HBV-LP下降趋势一致，HBV-LP出现阴转的时间要晚3个月于HBV-DNA阴转；抗病毒治疗无效的患者HBV-DNA和HBV-LP都是始终没有出现阴转；抗病毒治疗效果反复组中患者HBV-LP始终没有出现阴转，HBV-DNA则暂时阴转。

    结论
    拉米夫定抗病毒治疗过程中动态检测乙型肝炎病毒大蛋白可用于评估抗病毒治疗效果。

    [主题词] 乙型肝炎病毒大蛋白；肝炎病毒, 乙型；抗病毒治疗

Application  of serum hepatitis B virus large surface protein determination in  lamivudine anti-viral therapy for patients with hepatitis B  LI  Guang-yi, SHENG Jiang-lai, HUANG Hai-jun. People's Hospital of Anji  County, Zhejiang Province (Li G and Sheng J), Anji, Zhejiang, 313300,  China and The First Hospital Affiliated to Zhejiang University (Huang H)【Abstract】Objective To study the correlation between serum hepatitis B virus large surface protein （HBV-LP）and  hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) load in hepatitis B patients treated  with lamivudine, and the application of serum HBV-LP measurement in  evaluation of lamivudine therapeutic effect and end point judgement. Methods HBV  DNA was detected by fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR), serum HBV-LP  was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Both  HBV-DNA and HBV-LP decreased in patients responding to lamivudine  therapy, and HBV-LP turned negative 3 months later than HBV-DNA. In  patients resistant to lamivudine therapy, neither HBV-DNA nor HBV-LP  turned negative. In patients whose symptoms relapsed, HBV-LP didn’t turn  negative, while HBV-DNA was undetectable only transitorily. Conclusion  Measuring serum HBV-LP dynamically can be useful in evaluation of lamivudine therapeutic effect.

[Key words] Hepatitis B virus; Hepatitis B virus; large surface protein; Antiviral therapy

作者单位：313300 浙江省安吉县人民医院（黎广益、盛江来）；浙江大学附属第一医院研究生（黄海军）

乙型肝炎病毒(hepatitis  B virus, HBV)  感染是我国常见的引起慢性肝炎的病毒感染之一，随着人们对乙肝病毒的认识越来越深入，在预防、诊断和治疗方面都有所突破，但传统常规诊断方法（如乙肝三系和HBV-DNA检测）已不能全面、真实、快速的反应乙肝病毒在患者体内感染状况和抗病毒治疗的效果[1.2]。近年来随着对乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）在乙肝发病机制、感染与复制等方面研究的深入，研究人员逐渐认识到HBV-LP具有越来越重要的临床意义。我们使用HBV-LP酶免试剂盒，动态检测拉米夫定抗病毒治疗过程中HBV-LP含量，用于评估拉米夫定抗病毒治疗效果以及判定治疗终点。

1 材料与方法

1.1   研究对象  31名拉米夫定抗病毒治疗患者为我院和浙医一院2005年7月至2007年11月住院或门诊患者，其中男性20例，女性11例，年龄23~63岁，平均年龄39岁，抗病毒治疗之前均符合2000  年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中的病毒性肝炎诊断标准。

1.2  样本采集 在乙肝患者抗病毒治疗期间设立检测点，分别治疗后是0、3、6、9、12个月，每个检测点时被观察对象均于清晨空腹抽取5 ml 外周静脉血，2000G离心10 min ，分离血清并检测HBV-LP、HBV-DNA、HBV-M等。

   
           1.3  试剂和方法  乙型肝炎病毒大蛋白采用酶联免疫方法检测，试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供；HBV-DNA实时荧光聚合酶链反应(PCR)定量检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司；乙肝两对半（HBV-M）酶联免疫检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。所有试剂盒均在有效期内，均严格按试剂盒操作说明进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析计量资料用.x ±s 表示,计数资料用率表示。

2  结 果

2.1  抗病毒治疗有效的患者HBV-DNA和HBV-LP变化趋势比较：
     以用药12个月时HBV-  DNA出现阴转（拷贝数＜103）为抗病毒治疗有效，共有18例患者在为期12个月的拉米夫定抗病毒治疗过程中治疗有效，表1中的数据显示，在治疗过程中HBV   DNA的下降趋势和HBV-LP下降趋势一致，但是HBV-LP出现阴转（吸光密度A值＜0.105）的时间要晚于HBV-DNA出现阴转，HBV-LP阴转的时间平均比HBV-DNA的阴转晚3个月左右。

表1 有效组中HBV-DNA拷贝数对数值、HBV-LP A值平均值、阴转率比较

Tab.1  Logarithm of HBV-DNA copy numbers, HBV-LP A value and negative conversion rate in patients responding to lamivudine therapy

2.2   抗病毒治疗无效的患者HBV-DNA和HBV-LP变化趋势比较  以治疗12个月中HBV-  DNA没有出现阴转（拷贝数＜103）为抗病毒治疗无效，共有10例患者，HBV-DNA和HBV-LP都是始终没有出现阴转，而且HBV-LP均是在较高的水平（A＞1.0）。

    表2 无效组中HBVDNA拷贝数对数值和HBV-LP A值平均值比较

Tab. 2  Logarithm of HBV-DNA copy numbers and HBV-LP average A value in patients resistant to lamivudine therapy 

     2.3  抗病毒治疗效果反复组中患者HBV-DNA和HBV-LP变化趋势比较   以治疗过程中出现了HBV-DNA阴转（拷贝数＜103），但是之后HBV-DNA又出现阳转为抗病毒治疗效果反复，共有3例患者，图3中的变化趋势显示，在治疗过程中HBV-DNA出现了暂时阴转，而HBV-LP但是始终没有出现阴转。

    表3 反复组中HBV-DNA拷贝数对数值和HBV-LP A值平均值比较

Tab.3  Logarithm of HBV-DNA copy numbers and HBV-LP average A value in patients whose symptoms relapsed 

    3   讨 论

      慢性乙肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因，抗病毒治疗是阻止肝硬化进程及肝癌发生的关键措施，但是抗病毒治疗药物尤其是核苷类似物尚无可靠的治疗终点，以目前用的最多的核苷类似物拉米夫定（LAM）为例，  LAM 治疗出现HBeAg血清转换后复发率较高[3-6]，HBeAg  血清转换并不能用于判定治疗终点。另外，拉米夫定等核苷类似物只能抑制HBV-DNA复制，不能彻底清除cccDNA[7。8]，  而共价闭合环状DNA（cccDNA）是乙肝病毒前基因组复制的原始模板，因此血清HBV DNA虽然可以用作评估抗病毒疗效的重要指标，  但HBV-DNA的阴转也不能做为抗病毒治疗的终点。
 
     乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）与病毒的侵入、成熟和组装密切相关，其不仅存在于Dane颗粒上，还存在于不含HBV  DNA的管状颗粒上。抗病毒治疗直接抑制HBV-DNA复制，但残留的病毒前基因组仍将合成蛋白并组装成不含DNA的管状病毒颗粒，因此管状病毒颗粒仍将延续存在一段时间，直至病毒基因组衰减完。本研究对31例拉米夫定抗病毒治疗患者进行动态的监测，结果显示在治疗有效组中，HBV-LP和HBV-DNA的变化趋势一致，但是比HBV-DNA的阴转要晚，平均阴转时间要晚3个月。

     Summers[9]发现乙型肝炎病毒大蛋白具有上调cccDNA拷贝数的功能、激活cccDNA再复制等功能；Bruns  M以鸭乙型肝炎为模型，发现管状颗粒上的乙肝病毒大蛋白反式激活并显著增强细胞内的病毒复制和基因表达[10]。过量乙肝病毒大蛋白在肝细胞内积聚是导致内质网应激的关键因素[11]，血液中大蛋白残留与病情反复密切相关。本研究中发现治疗无效组中HBV-LP和HBV-DNA均始终没有出现阴转；在治疗反复组中HBV-LP始终没有出现阴转，HBV-  DNA则暂时阴转后反弹。

    目前临床抗病毒治疗过程中，在HBV DNA阴转后通常会继续用药以防止病情反复，由于乙型肝炎病毒大蛋白晚于HBV- DNA的阴转，并具有反式激活病毒复制能力，因此在监测病毒复制、观察治疗效果上具有重要作用。

4 参考文献
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[2] Kidd-Ljunggren K,Miyakawa Y, Kidd AH. Genetic variability in hepatitis B viruses. J Gen Virol, 2002,83:1267-1280.
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[4] Dienstag JL , Cianciara J , Karayalcin S , et al . Durability of
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[6] van Numen AB , Hansen BE , Sub DJ  , et al . Durability of HBeAg seroconversion following antiviral t  herapy for chronic hepatitis B: relation to type of t herapy and pret  reatment serum hepatitis B virus DNA and alanine aminot ransferase, Gut  2003 ,52 :420-424.
[7] Luscombe , CA , Locarnini SA. The mechanism of  action of antiviral agents in chronic hepatitis B . Viral Hepat 1996 ,  2: 1 - 35.
[8] Lai CI, Ching CK,Tung AKM, et al, Lamivudine is  effective in suppressing hepatitis B virus DNA in Chinese hepatitis B  surface antigen carriers :a placebo controlled trial Hepatitis,1997,  25:241.
[9] Summers, J., P. M. Smith, M. Huang, and M. Yu. 1991.  Morphogenetic and regulatory effects of mutations in the envelope  proteins of an avian hepadnavirus. Virology. 65:1310–1317.
[10] Bruns  M, Miska S, Will H. et al. Enhancement of hepatitis B Virus infection  by noninfections subviral particles. Virology,1998，76;1462-1468.
[11]  Chua PK, Wang RY, Lin MH,et al.  Reduced secretion of virions and  hepatitis B virus (HBV) surface antigen of a naturally occurring HBV  variant correlates with the accumulation of the small S envelope protein  in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. J Virol  2005,79:13483-13496。