如采用改良过碘酸钠简化法制备酶结合物，比原法更简便、快速，所获制品质量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇（AR）沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇（尽量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊或马抗人IgG（内含蛋白量20mg左右），搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg NaBH4 混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50%饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐（需换液5次），如有沉淀藉离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60%甘油PBS，分装保存备用。
制备好的酶结合物，要作两者克分子比和使用稀释度的测定，标记率的测定(A403/A280—0.4—1.0为宜)。
1、酶结合物克分子比测定：将制备好的酶结合物经适当稀释在分光光度计中以280nm和403nm测O.D值，然后按下列公式计算两者的克分子比。
（1）酶戊二醛交联法的计算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4为酶O.D403nm=1.0时相当于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42为酶蛋白结合戊二醛后在280nm应有的O.D，抗体球蛋白0.62为蛋白质与酶--戊二醛结合后O.D280nm值约应以加6%，故以0.94校正之。换算系数，故最后要乘于0.62。
(2）用过碘酸纳氧化法的计算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3为酶蛋白本身在280nm应有的O.D值。
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶结合物的克分子比。
一般要求制备好的酶结合物二者克分子比在0.8-1.2，但不能超过2或稍高。
2、酶结合物使用稀释度测定：先将一定浓度的抗原（如为抗人酶结合物，则用1μg/ml正常人IgG）包被固相载体，洗涤后加一系列不同稀释度之酶结合物进行孵育，洗涤加底物显色，并终止反应。在酶标比色计中测定不同稀释度酶结合物的O.D值，选择O.D值≥1.0的那个酶结合物稀释度即为本批酶结合物的使用浓度，见表中约1：12000稀释。
酶结合物稀释度 1：3000 1：6000 1：9000 1：12000 1：15000 1：18000
O.D值 2.45 1.96 1.59 1.12 0.74 0.405
（五）洗涤剂与稀释剂：为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处,增加本底颜色,产生假阳性反应,这是限制ELISA特异性的一个因素.因此不少学者在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。已经证明牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA为0.5%～1%；吐温—20为0.05%。（有人曾经比较了四种洗涤剂，结果认为蒸馏水加0.05%吐温-20或0.02
mol/L
PBS（PH7.4）加0.05%吐温-20都是良好的）。在一般的洗涤剂和稀释剂中还加有NaN3防腐，但是用HRP制备酶结合物时则不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗涤剂或稀释剂中虽可改善ELISA的结果观察，但由于BSA比较昂贵，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗涤剂中加入0.1%白明胶，2%免血清，有利于加强封阻作用。最近有人报告用PH7.4
0.02 mol/L
Tris-Hcl缓冲液中加入0.05%吐温-20作洗涤剂，效果很好，被检血清和酶结合物的稀释剂，可与洗涤剂相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀释剂和洗涤剂中所加的吐温-20很重要。它不仅能消除非特异性的本底反应，而且还可增加阳性标本的敏感度，这可能与吐温-20能分离所吸附的非特异性物质有关。目前采用的洗涤剂为PH7.4
PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐温-20，如无吐温-20，也可用吐温故-40或吐温-60代替。但吐温-80本底较高，不宜应用。（0.5
mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀释剂中，可提高特异性。
（六）底物：各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物。一旦酶结合物已经确定（如AP或HRP），那么可供选择底物的范围是很有限的。在这有限底物的范围内如何选择合适的底物呢？应按下列几个条件进行选择。（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚；（2）所显色泽易干洗脱；（3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的；（4）价廉，易得而且无毒。
因此，对AP酶结合物来讲，一般均用硝基苯磷酸盐，显色后呈桔黄色，色泽稳定，用2 mol/L NaOH终止反应，可用波长403nm测定O.D值。AP催化底物产生颜色的反应如下：
因AP是一种磷酸酯酶,它能催化磷酸酯(硝基苯磷酸盐)水介释放出无机磷酸而显色。
对HRP酶结合物来说，主要通过酶的催化作用使过氧化氢还原。同时使另一个底物氧化产生色变，可供选择的底物有几种，过去都用5-氨基水杨酸，它经酶催化后产生棕色产物便于观察，缺点是容易产生沉淀，用于定量测定时有困难。目前大多数使用邻苯二胺（Ortho-Pheny
lene-diamine，简称OPD），稳定、敏感，其降解产物呈桔红色，可溶。用2 mol/L
H2SO4或柠檬酸终止反应，可在492nm波长的酶标比色计上测定O.D值，也可目测。HRP在催化反应中可使H2O2分解出新生态氧，本身还原成水，而使OPD氧化生成有色产物，反应式如下：
O、P、D对光不稳定，故加后需放暗处作用。但据报告有致突变性，
O.P.D对光不稳定，故加后需放暗处作用，但据报告有致突变性，使时需注意。此外尚可选用邻联甲苯胺（Ortho-Toli
dine，简称OT），显色以后呈兰色，可用波长630nm测O.D值，不需终止反应。也可用目测，但显色后不稳定，40分钟色泽会自行减退，故需及时测定结果。加终止剂后呈现黄色，则需用波长405nm测定O.D值。
底物配制方法如下：
1、用O.P.D作底物：先配制PH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。取0.1
mol/L（19.2克/升），柠檬酸溶液24.3ml，加0.2
mol/L（27.4克/升）Na2HPO4溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，然后将40mgO.P.D溶解其中，再加30% H2O2
0.10ml即可应用，用时新鲜配制、避光。
2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸盐缓冲液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸钠（16.4克/升）溶液等量混和，然后称取OT
21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再将OT溶液倾入100ml PH3.7的醋酸盐缓冲液中，并加入30%H2O2
0.05ml即得，用前新鲜配制。
（七）作用时间：加底物后要多长时间终止反应测定结果呢？一般可采取二种方法。
1）任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进行校正，校正可按下列公式：
2）制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时，当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
国外在使用自动测定仪时，加底物后随时测定，每块试验板上阳性参考血清的O.D值，当其达到1.0时，立即将全板上被试标本终止反应进行测定，这样所得结果比较一致。我国也有自动酶标测定仪，但由于固相载体不够均匀，也很难用板来直接测定。
在ELISA中所加酶结合物之浓度，加后孵育时间以及加底物后孵育时间。这三个因素也是互相有影响的。一般讲，酶结合物浓度低，则要求孵育时间长些，而酶结合物浓度高则要求孵育时间短些，可根据实验的具体情况，变更不同因素，以取得良好的结果。
由于ELISA中变异因素多，对于要诊断某一疾病时，必须进行一系列实验室预试，摸索，或叫实验研究，在酶结合物已经确定的情况下，一般要求预测以下5个条件：
（1）抗原包被浓度；
（2）被检血清稀释度，即测剂量反应曲线；
（3）第一抗体作用时间；
（4）酶结合物作用时间；
（5）底物作用时间。
一旦试验条件摸清，以后在正式测定时，必须固定条件，不要随时改变，以使试验系统保持足够的稳定性。
（八）结果判断:ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观察更为简便，而且也有一定正确性。据Adler（1980）报告,目测为±1+、2+、3+、4+相当于分光光度计测定O.D值。
不论用哪种方法判定结果，每次都要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可以消除一些外界的影响因素。
≤0.04“±” 0.06～0.092和0.08～0.25“+”
0.26～0.5“++” 0.51～1.0“+++” > 1.0“++++”
(九)试验的重复性（精确度），有二种方法来检验试验的精确度：通常用变异系数来表示：1、几个样品用ELISA法同时进行多次测定求出CV%；2、不同时间对不同操作者对某几个样进行多次测定求出变异系数。CV是个体参数标准差与平均数的比率。
S / X ＝ CV ，CV应低10%，不应大于10～15%。
不论目测或分光光度计测定，均可作一个稀释度或一系列稀释度测定，一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了，这样比较方便，现在推荐传染病的血清诊断用1：200一个稀释度。有些需要精确定量的，可作一系列稀释度测定。
记录结果有下列几种方法：
1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4）的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。
2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。
3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。
4、以“比值”表示：求出被检标本的O.D值与一组阴性标本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。
测定标本O.D值-空白O.D值
—————————————≥2.1
阴性对照O.D值-空白O.D值
如在此测定时以空白校正“O”点。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
作试验时的阴性参考血清最好不要显色，否则会对结果判断带来困难，特别在目测时，当阳性标本O.D值>2.0时，应作适当稀释后再作测定。
（十）对使用仪器要求：所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化。
四、具体操作法
上面已经把ELISA中各步骤的影响因素作了说明，为了便于工作下面把ELISA的操作程序列于表1供参考：
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