脂蛋白（a）[Lp(a)] 是心血管疾病危险的重要预示因子。许多研究说明，血浆Lp(a)水平的升高与心血管疾病危险增加有关。对12个预期研究的meta分析，将1617例冠心病（CHD）与10035例对照组的Lp(a)浓度转换为相同计量单位后，认为：Lp(a)为CHD的独立预期危险因子；当LDL-胆固醇也增高时，对95％的白种人的男女具有相似的影响；但是，它与无突出的一期或二期高脂血症的冠状动脉疾病的进展无关。另外，无论国内或国外，各个实验室间的Lp(a)检测结果缺少可比性，一个患者标本的Lp(a)结果，使用不同的试剂或检测系统，可以出现相差数倍的差异，限制了它在临床中的广泛应用。为此，国际临床化学与检验医学学会（IFCC），于1995年成立Lp(a)工作组，与国际研究机构、多个诊断公司一起，为建立Lp(a)国际参考物质进行探索。历经8年努力，终于在2004年，IFCC 的生物标准化专家委员会接受了“IFCC SRM 2B”为国际上第一个Lp(a)免疫测定的WHO/IFCC国际参考试剂。该参考物质的每个安瓿内的Lp(a)为0.1071nmol，可溯源至Lp(a)的协同参考方法；将使诊断公司的校准品在计量上溯源性符合欧洲共同体的体外诊断医学产品通则。本文将对Lp(a)标准化的有关内容作介绍。
一．Lp(a)结构的特殊性是使检测结果不一的重要原因
为说明这项标准化工作的特殊意义，应当首先了解Lp(a)结构。图1为Lp(a)的结构。
在结构上，Lp(a)内的核心含有丰富的脂类，周围具有富含碳水化合物的高度亲水蛋白，称为载脂蛋白（a）[apo(a)]外，还有载脂蛋白B-100（见图1左侧）。Lp(a)颗粒含有的apo(a)和apo B呈1:1的摩尔比率。在Lp(a)颗粒内，apo(a)和apoB-100间以一个二硫键互相共价结合。
经研究了解，发现Lp(a)的特殊性质。它的大小和密度呈非均相性，完全因为是apo(a)的独特性。apo(a)是富含碳水化合物的蛋白，在个体内或个体间的颗粒大小变异大。从内在结构上，发现apo(a)和丝氨酸蛋白水解酶原的纤溶酶原有着高度的均相性。纤溶酶原含有蛋白水解酶区域（domain），每5个domain的复制物称为环饼结构[kringle]，这样的环饼结构依次从环饼1到环饼5。每个环饼结构是高度保守的、具有三环（loop）的多肽结构，籍三个二硫键予以稳定，这样的结构也发现于其他在出凝血和纤维蛋白溶解中的蛋白。三环结构在形态上相似于丹麦的馅饼－环饼（kringle），由此命名为环饼。
apo(a)的基本结构可参见图2。apo(a)含有一个环饼区域（kringle domain）和一个羧基端的蛋白水解酶区域，后者被证实了约有85％的氨基酸组成和纤溶酶原的蛋白水解酶区域相似。除了在apo(a)和纤溶酶原蛋白水解酶区域间具有高度的顺序重叠外，由于在这个区域内关键氨基酸被取代，和apo(a)结合的部分没有蛋白水解的活力。环饼结构区域由11段可区分的环饼类型组成，其中10段很相似，但是相互间不一致；后面为纤溶酶原环饼K5结构，该K5区域和纤溶酶原的K5结构具有超过85％的氨基酸是一致的。这10个似纤溶酶原环饼K4区域作为环饼4（K4）的第1段到第10段是一样的，它们的顺序和纤溶酶原K4的一致性达到78％～88％。Apo(a)K4第1段和第3段、一直到第10段似乎在每个apo(a)分子中都只是一个环饼（copy），而K4的第2段存在着多个重复结构、数量上最少为3个，最多可达40个。K4第2段重复的数量不一对apo(a)以及最终的Lp(a)的大小非均相性是关键问题，形成了不同的apo(a)的异构体（isoform）。最后一个为K5段，它和纤溶酶原的K5高度相似，最后为丝氨酸蛋白水解酶。apo(a)和纤溶酶原在结构上相似。所以apo(a)被认为是纤溶酶原基因家族的一部分，该家族还包括出凝血和纤维蛋白溶解关联的其他蛋白。纤溶酶原也含有5个环饼区域（kringle domain），各称为K1、K2、K3、K4和K5。后面还有一个丝氨酸蛋白水解酶区域（见图3上半部）。
apo(a)和纤溶酶原相比，没有纤溶酶原前面的K1、K2和K3环饼区域。所以在解释apo(a)结构时，一开始就将所有多变的环饼区域称为K4区域。该区域有多个相似或相同的环饼结构组合起来，替代了纤溶酶原的K4部分结构。后面为一个和纤溶酶原K5高度相似的K5区域；最后为丝氨酸蛋白水解酶（见图3下半部）。
综上所述，Lp(a)的多态性的根本问题是内含的apo(a)的多态性，特别是环饼区域K4的第2段中的相似环饼从3～40个不等。不论种族、性别、年龄、是否具有血脂代谢问题等，各个个体内的Lp(a)内、或各个个体间的Lp(a)间，apo(a)的多变是检测结果变异的主要原因。apo(a)的大小从187 kDa到662 kDa。大小的不均一影响了血浆中Lp(a)免疫化学检测水平。在免疫检测中，抗体若是抗重复的K4第2段抗原，apo(a)颗粒小于存在于检测校准品内apo(a)的，Lp(a)结果偏低；反之，结果偏高。只有使用可识别每个apo(a)上仅一个类型环饼结构蛋白片断的、或抗apoB-100（apoB）的、或Lp(a)其它蛋白组分的抗体，才能准确地检测Lp(a)。另外，使用mg/L的质量单位表示Lp(a)是不准确的，因为在各个Lp(a)颗粒中，apo(a)与apoB的质量比率各异。所以，应以nmol/L表示Lp(a)蛋白含量。
二．选择参与Lp(a)标准化工作的检测系统
1．确认一致同意的Lp(a)参考方法
为了准确检测所有血浆样品中的Lp(a)，与apo(a)颗粒多态性无关，在美国西雅图的华盛顿大学西北脂类研究实验室，使用抗apo(a)的K4 type9的表面决定簇的单克隆抗体，形成了直接结合的双单克隆抗体酶联免疫测定方法（a-40 ELISA），检测血浆中的Lp(a)。许多研究工作者对该检测方法作了详细的评价，说明apo(a)的不均一不影响测定准确度。使用抗apo(a)K4 type8决定簇的不同检测抗体，又形成了另一个免疫测定（a1-1 ELISA），也显示了它对apo(a)异构体大小不均一的不敏感。因为以上任何单克隆抗体都不会与apo(a)分子的多变部分的决定簇反应，可以摩尔（mol）单位表示设定靶值。
2．选择合适的Lp(a)参考物质
在标准化的第一阶段，对8个Lp(a)商品校准品检测了分析性能，其中一些校准品显示了在精密度、线性与平行性的测定特性上，与血清样品具有可比性。对Lp(a)值单位处理后，一些校准品的Lp(a)值在方法间很靠拢，但其它的离散很大。因此，IFCC工作组不采用现有的任何公司校准品为候选的参考物质。
在第二阶段，对4个新制备的材料检测了精密度、线性、互通性以及方法一致性等，使用了27个检测系统予以检测（表1）。
注：IHSP（in-house serum pool，自制混合血清）；FSCC（frozen serum control C，冰冻血清控制品C）。
注1：是对于IHSP最优化的检测系统（即在对人血清检测属最佳的系统）；
注2：精密度为检测系统内CV的中位数。这是对50%与100％的PRM进行Lp(a)重复检测的结果；
注3：线性评估：对PRM从20％～100％，互相间隔10％的Lp(a)线性实验；判断：线性回归的斜率为0.9～1.1，截距在－10％～＋10％间，为线性。
注4：平行性：对9个同一个稀释度的PRM、FSCC与IHSP进行Lp(a)检测，用单向的ANOVA比较它们的回归斜率；若可能性p＞0.01，认为具有平行性。
注5：评估检测系统的协同性：对系统间校准差异作Lp(a)浓度纠正后，系统间检测结果差异的CV％。（依据FSC C为标准）。
经比较，SRM 2B使18个INA与ITA检测系统的变异小于8％（表2），显示分析性能可接受；以及在稳定性上表现良好。所以选择SRM 2B为Lp(a)的通用校准品，用于进行一致性检测调查前，为各个系统的厂商校准品定值。
注：CHOL方法为Lp(a)-胆固醇-测定；DELFIA方法为dissociation－enhanced－ligand 荧光免疫测定；INA为免疫散射比浊测定；ITA为免疫透射比浊测定。在检测SRM 2B的Lp(a)浓度时，均以FSC C为标准，校准后检测SRM 2B的100％与50％的质量浓度。然后将正确的质量浓度值转换为nmol，以a-40 ELISA的Lp(a)结果为准予以换算。
3．确定Lp(a)的一级参考物质
对来自含有19个K4区域的单一apo(a)异构体的供体血清，在两个独立实验室分别进行Lp(a)的分离与纯化。一个实验室使用连续超离心与分子网层析等技术分离；另一个实验室采用赖氨酸-葡聚糖凝胶过滤和氯化铯分级超离心技术分离纯化Lp(a)。二者Lp(a)的化学组成非常相似；每个分离制品作氨基酸重复分析，确定Lp(a)蛋白作摩尔单位的准确绝对质量。成为Lp(a)一级参考物质。
4．对SRM 2B的Lp(a)定值
使用两个实验室制备的Lp(a)一级参考物质，为SRM 2B设定靶值。使用对每个新鲜制备的分离Lp(a) 。使用一致统一的两个ELISA参考方法（使用的单克隆抗体分别为a-40或a1-1）进行定值。两个参考物质、两个参考方法组合的四个检测系统，每一个系统均绘制6点的标准曲线，每点重复4次。共进行4天实验，每天在各个组合系统的3个板上，各对SRM 2B进行一组双份测定。同时，在每个板上分析4个控制品，每个控制品进行双份检测。在4个连续天内，共得到SRM 2B的144个结果。所有定值结果可参见表3。无论使用哪一个Lp(a)一级参考制品、或无论使用哪一个ELISA参考方法，对SRM 2B的定值非常相似，最后的定值为：107.1nmol/L±8.6 nmol/L。
5．SRM 2B的组成与表现
每个SRM 2B的安瓿内含有混合人血清、稳定剂与防腐剂叠氮钠（1.08 g/L）的冻干物。复溶的SRM 2B内含有以下的各个脂类在低或正常的水平：胆固醇（3.6 mmol/L），甘油三酯（0.6 mmol/L），LDL-胆固醇（2.3 mmol/L），HDL-胆固醇（1.0 mmol/L）；蛋白为37 g/L。样品经1：100稀释后，浊度＜1％光散射单位、或于340 nm处的吸光度为0.0132，可以忽略不计。Lp(a)的异构体由三个主要的apo(a)多形体组成，在凝胶上表现几乎相等的强度，各含有16、17与18个K4环饼结构。三个最少的多形体分别为14、20与32个K4环饼结构。
经观察，SRM 2B的Lp(a)含量与电泳表现，6年没有变化。在这段时间内，使用SDS-琼脂糖电泳与免疫印迹检验，没有发现apo(a)增加的区带或凝集产品。复溶后，若紧盖并保存于2～8℃，可稳定1周。复溶液不能冰冻，若出现沉淀应弃去。
三．Lp(a)标准化工作的第三阶段：使用推荐的SRM 2B参考物质后对实现患者血清检测结果一致性的评估
22个检测系统以SRM 2B校准后，检测三个控制品，Lp(a)的浓度在29、104与185 nmol/L，方法间的CV分别为：11.9％、11.5％与9.5％。然后各个检测系统使用校准值可溯源至SRM 2B的自制校准品，校准系统后再检测这三个控制品，结果与上述几乎一样。另外，在排除一个有问题的系统后，方法间检测SRM 2B的CV仅2.8％；除了一个系统外，其余系统结果的均值与靶值差异在5 nmol/L内。
以这些结果为基础，在第三阶段由16个厂商与6个研究实验室对SRM 2B材料评估，确定它是否具有将基础的准确值传递给厂商的校准品的能力；并经该物质标准化后，在各个方法间结果的一致性的能力。选择了30份健康供体的新鲜冰冻血清，内含Lp(a)值与apo(a)异构体范围大而广；具有的K4 apo(a)区域为13～31个、Lp(a)含量范围为10～414 nmol/L，使用a-40 ELISA Lp(a)参考方法为之定值。各个Lp(a)检测系统包括：10个免疫透射比浊测定（ITA）、8个免疫散射比浊测定（INA）、2个荧光免疫测定（FIA）、1个免疫电泳测定和1个ELISA。几乎所有的检测系统均使用多克隆抗体抗检测Lp(a)的apo(a)部分，来检测Lp(a)，有2个ITA方法使用标记于胶乳颗粒的单克隆抗体，1个FIA方法（DELFIA a/B）使用了抗apoB作为检测抗体的多克隆抗体。
30例样品的检测结果CV从6％～31％。样品浓度在Lp(a)＜25 nmol/L的，CV为19％～31％；Lp（a）在100～414 nmol/L的，CV为6％～17％。每个Lp(a)检测系统的检测值与协同的参考检测系统的定值作比较，评价各系统的准确度。结果说明在30份样品中apo（a）异构体范围大，各检测系统对apo(a)大小的非均一很敏感，对于apo(a)异构体分布广泛的各个样品，检测结果变异明显大于SRM 2B。Lp(a)的胶乳增强ITA方法是最准确的检测系统，它们的平均绝对偏倚仅4.4 nmol/L；其它方法的偏倚为12.4～23.8 nmol/L。仅两个Lp(a)检测系统对apo(a)异构体的非均一具有最小的偏倚。通过使用SRM 2B，在Lp（a）的胶乳增强ITA方法与Lp(a)的协同参考a1-40 ELISA测定间，具有了极其重叠的Lp(a)结果。很明显，无论是一级或二级的参考物质，因为apo(a)大小的非均一的影响，都不能消除不同分析方法间得到的Lp(a)值的实质性差异。
四．WHO生物标准专家委员会批准IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”
WHO生物标准专家委员会在批准IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”中，不仅要求标准化计划的实验设计与实施具有科学性，而且也要求文件完整，报批过程严密；为此，所有工作又延长了3年才完成。这些包括：技术报告的编写、对IFCC SRM 2B长期储存与监视的数据收集、将参考物质与确认材料分送评估等。初步批准该物质为可行的参考物质的是IFCC科研部门成员，然后是IFCC的执行董事会，是他们于2002年早期将IFCC SRM 2B上交给WHO，要求认可为Lp(a)国际参考试剂。技术报告送给WHO生物标准专家委员会（WHO ECBS），希望在2003年2月的年会前作评论。经初步评估，WHO还要求进一步明确系列技术要点，特别是物质在高温下、复溶后的稳定性，批间的恒定性，以及分送评估的文件。并要求最终表示为每个安瓿的含量，而不是Lp（a）浓度，还需要Lp(a)定值的不确定度。确保实施ISO导则，实现可追溯性与检测的不确定度。
最后，WHO在2003年11月，正式接受IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”，完整的称呼为：WHO/IFCC SRM 2B。该参考物质储存于玻璃安瓿，内含0.1071±0.0086 nmol的Lp(a)（依据分装时的不精密度，变异为2.9％）。它的定值可追溯至Lp(a)的协同参考检测系统。依据欧共体的体外诊断医学产品通则（IVDD），要求诊断公司的校准品值在计量上可追溯至较高水平的参考物质。使用WHO/IFCC SRM 2B将符合IVDD的要求。IFCC SRM 2B保存在美国西雅图的西北脂类研究实验室，供Lp（a）研究部门与诊断厂商使用。
总之，IFCC的Lp(a)测定标准化工作组的初衷，已经为统一免疫测定Lp(a)结果提供了实在的解决方法。所以，通过IFCC的努力，校准Lp(a)检测系统的全球性协同已经实现。WHO/IFCC SRM 2B的使用将消除检测系统间变异的主要因素。通过使用标准化方法可溯源至“第一个WHO/IFCCLp(a)免疫测定国际参考试剂”，如推荐那样，现在可以作出确定在各种人群中未来心血管疾病危险增加的判断限。
五．将Lp(a)定值转移给靶物质的程序
在提供SRM 2B的同时，还有3个冰冻血清，以确认值转移的成功。
1． 使用复溶的SRM 2B（Lp(a)值107.1 nmol/L），依据您日常的检测方案校准您的Lp(a)测定。应将SRM 2B配制于磷酸盐缓冲液，作预先稀释。
2． 在2天内，进行两批实验；每批对3个您的一级校准品分别进行4次检测。一共得到48个Lp(a)值。
3． 每批应进行校准曲线的绘制。
4． 确定您一级校准品的Lp(a)均值与标准差。
5． 使用一级校准品得到的Lp(a)均值，按照您日常Lp(a)测定程序进行校准。
6． 冻融3个水平的冰冻血清样品各一支（A0x、B0x、C0x），内含不同大小的apo(a)，在您的Lp(a)测定程序中检测，以确定值转移程序的准确度。
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