属β-内酰胺酶与绿脓假单胞菌亚胺培南耐药

 绿脓假单胞菌是临床常见条件致病菌，尤其是在医院感染中占有非常重要的位置。由于对其多种抗生素耐药使得临床抗生素的选择越来越受到限制。亚胺培南(imipenem)为碳青霉烯类抗生素，有极强的抗菌活性，8 mg/L浓度的亚胺培南可抑制98%以上的临床主要致病，对沙雷菌属、不动杆菌属、绿脓假单胞菌都有较强的抗菌作用，特别适用于治疗严重的医院感染及缺陷患者。但是随着亚胺培南的广泛使用，抗药株在逐年增加，Fass等［1］报道绿脓假单胞菌1983年亚胺培南敏感率为100%（67株），1986年为93%（2 046株），到1993年敏感率变为91%（1 246株）。

　　细菌产生的β-内酰胺酶大部分是活性部位带丝氨酸残基的酶类，目前大约有190种，但是也有一小部分活性部位为金属离子的酶类。金属酶不仅对内酰胺酶抑制剂的敏感性差而且能够水解包括碳青霉烯类（carbapenems）在内的一大类内酰胺类抗生素，因此金属内酰胺酶的研究越来越受到重视。

　　一、金属内酰胺酶的特点

　　1982年Saino等［2］从嗜麦芽窄食单胞菌中分离出一种内酰胺酶不仅能水解碳青霉烯类而且可以水解其他广谱内酰胺类抗生素，随后这种酶在嗜水气单胞菌、脆弱拟杆菌等相继出现。1989年Bush等［3］将这种酶定为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase）,归于内酰胺酶第Ⅲ类。目前又分为3个亚型，3a、3b和3c。3a主要作用于青霉素类、头孢菌素类，对亚胺培南水解能力较弱，3b主要针对于碳青霉烯类，多来自气单胞菌属、黄杆菌属和洋葱伯克霍尔德菌属等。3c主要产自军团菌，对氨苄西林、头孢噻啶作用较强。

　　二、绿脓假单胞菌金属内酰胺酶特点及其作用

　　绝大多数的金属β-内酰胺酶基因由染色体编码，因此限制了此酶的菌株间传播，因而导致临床普遍蔓延的可能性不大。染色体介导的金属β-内酰胺酶常存在于嗜麦芽寡食单胞菌、嗜水气单胞菌等菌株中，这些菌株在产生金属β-内酰胺酶的同时可产生其他含丝氨酸的内酰胺酶。但是目前质粒介导的金属β-内酰胺酶在脆弱拟杆菌、粘质沙雷菌、绿脓假单胞菌等菌株中相继发现，不过数量较少。Bandoh等［5］对日本610株脆弱拟杆菌分析发现只有6株产生金属β-内酰胺酶。

　　1991年Wantanabe等［6］从绿脓假单胞菌GN17203中分离出分解碳青霉烯类的β-内酰胺酶，由31-Mda的PMS350质粒编码，这种质粒可以诱导菌体对内酰胺类抗生素、庆大霉素和磺胺类等抗生素耐药，并可以通过接合（conjugation）方式传递给其他绿脓假单胞菌菌株。

　　Senda等［7］对来自17家医院的132株亚胺培南耐药的绿脓假单胞菌采用blaimp探针进行金属β-内酰胺酶基因分析表明其中15例 携带blaimp基因，但它们的质粒指纹图有一定的差异，但同一家医院则呈现出相似性。通过电穿孔（electroporation）技术绿脓假单胞菌的耐亚胺培南特性可以传递给大肠埃希菌。值得注意的是有两株绿脓假单胞菌虽然携带blaimp基因但只是呈低水平耐药（MIC＜4 μg/ml）,说明隐蔽性blaimp基因可能存在,单纯blaimp基因的获得不一定造成亚胺培南高水平耐药,可能还需要外膜蛋白及主动外排泵的参与。

表1　金属内酰胺酶的一般特性［4］

　　*表示锌离子不是活性离子，用EDTA处理后，锌离子不能恢复酶活性

表2　金属内酰胺酶对不同抗生素的相对水解能力

 　　+表示该抗生素能被金属酶水解，-表示不能被水解

　　三、绿脓假单胞菌对亚胺培南耐药产生的危险因素

　　Troillet等［8］对40株亚胺培南耐药的绿脓假单胞菌进行分析表明，应用亚胺培南药物抗感染是医院患者绿脓假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因，用过亚胺培南药物治疗的患者产生抗药的几率是没有用过的24倍。尽管如此数据显示用过亚胺培南的患者仅占耐药患者总数的15%。美国医院感染委员会调查结果显示从重症监护病房(ICU)患者分离出的绿脓假单胞菌菌株易形成亚胺培南耐药，原因可能是ICU患者有更多的机会接受亚胺培南治疗感染。

　　Statake等［9］认为患者接受过其他内酰胺类药物进行抗感染治疗则可能会激活β-内酰胺酶生成脱抑制，继而会诱导绿脓假单胞菌失去其孔蛋白OprD2，形成亚胺培南耐药。Rallberg等［10］发现亚胺培南与喹诺酮类抗生素具有一定的交叉耐药性，在试验中用环丙沙星诱导的13株耐药株中同时有8株对亚胺培南耐药。

　　四、亚胺培南药敏试验中存在的问题及其影响因素

　　由于亚胺培南广谱强大的抗菌效果，尤其是治疗严重的医院感染、混合感染非常有效，因此细菌给临床提供一个准确的药敏谱是非常重要的，但是受储存温度、时间和培养基的状态（干燥或冷冻等）的影响，亚胺培南的药敏结果常呈现出不稳定性。武汉申正义等［11］对354株绿脓假单胞菌分析表明亚胺培南耐药率为6%，上海乔静贤等［12］150株绿脓菌耐药率为17%，而北京的周贵民等［13］的结果则为11%（387株）。亚胺培南耐药率在各地存在着一定的差异，除了菌株流行区域差异外，实验室的检测质量也是一个重要因素。

　　最近研究表明，培养基介质中的2价阳离子浓度对亚胺培南药敏试验结果有很大的影响。Daly等［14］对68株绿脓假单胞菌亚胺培南耐药分析，其敏感性为56%，当锌离子分别调整为3 μg/ml和6 μg/ml时敏感性分别为51%和27%，锌离子浓度的增加,药物的MIC值随着增加，所以在临床试验中因锌离子浓度的不同，药物敏感的结果可能变为耐药从而影响临床用药的选择。培养基中的钙、镁、锰、铁等离子对药敏试验结果影响不大。目前国际上对培养基中锌离子浓度未做具体规定，BBL-MH琼脂中是2.61 μg/ml而Difco-MH中是0.17 μg/ml，相差15倍。Cooper等［15］用59株绿脓假单胞菌对亚胺培南进行药敏试验,结果证明以BBL-MH为基质的耐药率为33.9%，而以Difco为基质时只有5.1%，增加Difco中锌离子浓度MIC随之上升。但是锌离子浓度对肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌药敏结果影响不大，所以分析各地绿脓假单胞菌的亚胺培南药敏结果时应考虑到锌离子浓度的影响。

　　尽管体外试验证明锌离子对亚胺培南的MIC存在着很大的影响，但体内锌离子是否会对亚胺培南的杀菌效果产生影响则不很清楚。血清中锌离子正常浓度为0.8～1.3 μg/ml，所以如果亚胺培南的MIC值不是接近临界值（breakpoint）时，对亚胺培南的杀菌效果影响不会很大，但是脓液中锌离子浓度常为血清含量的2～3倍，所以有时尽管亚胺培南显示很好的体外抗菌活性但治疗的效果不甚满意［16］。

　　尽管金属β-内酰胺酶与其他丝氨酸-内酰胺酶相比种类和数量较少，但比其他内酰胺酶所引起的耐药性更为广泛，后果更为严重，了解这些对于控制金属酶的扩散有着重要的意义。另外，金属内酰胺酶不能被常用的酶抑制剂如棒酸等所抑制，而且金属酶的异质性使得研究专门针对于金属酶的抑制物很困难。必须强调金属内酰胺酶的产生并非是亚胺培南耐药的唯一因素,外膜通透性下降、其他β-内酰胺酶及mexA-mexB-oprK等介导的主动泵系统也起到非常重要的作用。