单细胞分析是研究细胞异质性的关键技术，对生物学过程研究及新药研发有着重要意义。目前，单细胞基因组学技术较为成熟，单细胞转录组学和蛋白组学分析技术近年来获得较多关注和投入。与其他组学相比，单细胞脂质组学分析刚刚起步，面临诸多技术难点。由于脂质数量庞大，结构复杂，其在单细胞层面的结构表征和定量分析颇具挑战。质谱仪因其高灵敏度、高特异性和准确定量能力，已成为单细胞脂质组分析的主要技术。然而，单个细胞内脂质等代谢物的精细结构鉴定（如碳碳双键位置和sn-位置）与定量分析仍面临着巨大挑战。
脂质的结构异常复杂，根据头基的不同，可将脂质划分为不同类型。此外，脂质的脂肪酸链（fatty acyl chain）、脂肪酸链位置（sn-position）、碳碳双键位置（C=C location）、双键几何构型（cis/trans）等结构特征均可变化，造成脂质异构体数量繁多。近年来，研究者们开发了多项技术，用于脂质的精细结构鉴定，包括臭氧诱导解离、环氧化和光化学（Paternò-Bǜchi，PB）反应等。同时，多项单细胞内脂质分析技术也已报道，包括探针电喷雾质谱、流式电喷雾质谱和单探针质谱等。然而，由于单细胞内的待测物绝对含量低和结构分析方法缺失等限制，单细胞内脂质精细结构的解析仍面临着重大挑战。
近日，清华大学精密仪器系马潇潇副教授和欧阳证教授带领研究团队，发展了一种基于质谱的新型单细胞脂质组精细结构分析方法。该技术利用自由基诱导解离、PB反应与多级质谱技术，实现了单细胞内脂质sn-位置异构体和C=C位置异构体的鉴定与相对定量，解决了哺乳动物单细胞内大规模脂质的精细结构分析这一关键技术难题。该技术的基本原理如图1所示：首先利用戊二醛对固定细胞进行固定，使细胞在水溶液保持形态完整。在电迁移和液滴辅助电喷雾作用下，固定后的单细胞完成实现高灵敏度质谱检测（图1b）。细胞固定后，磷脂酰胆碱（PC）的回收率可达90%以上。采用水溶性2-乙酰吡啶（2-AP）作为反应试剂，有效避免了衍生过程中细胞脂质的溶解问题。
图1. 单细胞脂质组的质谱精细结构技术（a）单细胞脂质精细结构解析流程图,（b）基于电迁移和液滴辅助电喷雾（DAESI）的单细胞质谱分析，（c）未固定和固定的细胞提取液内前级离子扫描（PIS）m/z 184扫描质谱图，（d）戊二醛固定下的PC回收率统计，（e）单细胞群体独立光化学衍生反应装置图。
结合串联质谱分析，研究人员实现了对单细胞内脂质C=C位置异构体的鉴定和相对定量分析。以单个MDA-MB-231中的PC 34:1（m/z 760）为例，其PB产物离子（m/z881）在串级质谱下可以产生三对诊断离子：636/725，650/739和678/767，分别代表PC 16:0_18:1(Δ8), PC 16:0_18:1(Δ9)和PC 16:0_18:1(Δ11)。进而利用这些诊断离子的相对强度即可实现相应脂质异构体的相对定量分析（图2a）。除PC外，该技术还可以用于脂肪酸（FA）、甘油二脂（DAG）、甘油三酯（TAG）、胆固醇酯（CE）等其他脂质的分析（图2b, c）。此外，还实现了单细胞内脂质sn位置异构体的鉴定和相对定量分析。以人乳腺癌MDA-MB-231细胞内的PC 34:1为例，其碳酸氢根加合物经多级质谱分析可产生两个sn特异性诊断离子，419和445，代表PC 16:0_18:1和PC 18:1_16:0。液滴辅助电喷雾使得单细胞多次采样和分析成为可能。实验结果表明，该技术可对单细胞进行至少八次采样，可实现多个脂质分子的精细结构鉴定和相对定量。
图2. 单细胞内脂质的精细结构解析。（a）单个MDA-MB-231内PC 34:1的C=C位置鉴定,（b）单个MCF-7内FA 18:1的C=C位置鉴定，（c）单个MCF-7内DAG 36:2的C=C位置鉴定，（d）单个MDA-MB-231内PC 34:1的sn位置鉴定。
该研究中，随后开展了对野生型（HCC827）和耐药型（HCC827/GR6）非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的单细胞精细脂质组学分析。从脂质分子相对定量、脂质sn位置异构体相对定量和脂质C=C位置异构体相对定量等层次分别开展研究（图3.a-d）。t-SNE降维聚类分析表明，仅脂质C=C位置异构体的相对定量分析能准确区敏感和耐药肺癌细胞。该团队在HCC827中检测到了约9%的耐药细胞，与文献报道的7~12%的结果高度一致，表明单细胞精细脂质组学分析在精准医疗方面具有不可替代的重要作用。
图3. 敏感型和耐药型NSCLC细胞的精准识别。（a-c）t-SNE降维聚类图，（a）由脂质分子相对含量分布计算而得,（b）由脂质sn位置异构体相对含量计算而得，（c）由脂质C=C位置异构体相对含量计算而得。（d）每种聚类分析中样品数目统计。（e）敏感型与耐药型细胞中含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1异构体相对含量比较。***p<0.001。（f）HCC827和HCC827/GR6单细胞内PC 32:1的C=C位置异构体相对含量分布。
最后，以四个典型单细胞为例，阐释了同一细胞系内不同细胞间的异质性，并研究了可用于耐药NSCLC细胞精准识别的潜在生物标志物。通过定量分析可以发现，含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1异构体相对含量在耐药型NSCLC细胞内含量为41.0±5.1%，在敏感型NSCLC细胞内含量为55.7±4.9%，可用于敏感和耐药细胞区分。例如，在来自HCC827细胞系的细胞1,3中，细胞1属于敏感型，细胞3属于耐药型；在来自HCC827/GR6细胞系的细胞2,4中，细胞2属于耐药型，细胞4属于敏感型。以上结果表明相同细胞系内的单细胞之间存在显著异质性，为耐药型和敏感型NSCLC细胞的区分提供了关键技术，对癌症等疾病的精准诊疗具有重要意义。
本研究的相关结果已发表于Nature Communications。该论文得到了国家自然科学基金项目的支持。
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