流式细胞仪检测细胞凋亡方法（Annexin V 法）

实验原理

Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
实验试剂

1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 6621E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：
Annexin V                                                   核酸染料
Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X)          PI(Cat. No. 662E)或
Streptavidin-FITC(Cat. No. 3024D)          7-AAD(Cat. No. 34321X)
Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X)            PI(Cat. No. 66211E)
Annexin V-PE(Cat. No. 65875X)                7-AAD(Cat. No. 34321X)
 
实验设备

1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. 微量加样器和加样头。
3. FACS流式细胞仪：上样检测。
4. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。
5. Annexin V检测对照管：
Annexin V    A-阴性对照    B-补偿1                                       C-补偿2
Biotin           SAv-FITC       Annexin V-Biotin和SAv-FITC    PI和SAv-FITC
PE                未染色细胞     Annexin V-PE                              7-AAD
FITC           未染色细胞      Annexin V-FITC                           PI 
 
实验步骤

1. 取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1× Binding Buffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。
4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：
    管号  名称        荧光标记Annexin V  核酸染料
    1     阴性对照     -                                 -
    2     单阳1        AV-FITC                      -
    3     单阳2          -                                  PI
    4     样本          AV-FITC                     PI
5. 轻轻混匀，室温(20°C ~25°C)避光处放置15分钟。
6. *使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：
1×Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1×Binding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5μl PI，室温(20-25°C)避光处放置15分钟。
7. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μl。
8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。