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流式细胞仪定量分析细胞凋亡

2021.5.20
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空空

好好工作,天天开心

流式细胞仪检测具有以下特点:
1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2)、可以做许多相关性分析
3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种:
1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·-OH端
2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。


丁香通
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