PCR是英文Polymerase chain reaction的缩写，翻译过来，称为聚合酶链反应。PCR自1983年由美国加利福尼亚的Cetus公司的Mullis博士发明到现在，虽只短短的二十多年，但其在生命科学研究和临床分子诊断中，已毫无争议的成为“支点”工具。如果没有PCR，人类基因组计划不可能在如此短的时间得已初步完成，涉及到基因操作的几乎所有研究将比现在花费更多的时间和财力。在临床实验室，病原体的检测仍将是培养和/或血清学试验的经典模式，即使有探针杂交，对于临床标本中微量的病原体，也是束手无策。PCR的出现，尽管其并没有“改变基因操作的本质”，但使我们能“更快更容易地进行基因操作”，原来我们需要半年、一年乃至更长时间才能完成的工作，现在我们可以在几个小时内完成。因此，在PCR的两大瓶颈问题即核酸扩增仪和耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在上世纪80年代末被成功解决以后，其很快在感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等诊断和研究领域得到了广泛的应用。PCR用于疾病的临床诊断，使人们拥有了从对蛋白分子表型的认识，进一步深入到了遗传物质——核酸分子的探索的有力工具，也使临床检验诊断学科中的临床分子诊断技术得到了飞速发展。
一、我国PCR技术临床应用的历史和发展
（一）临床PCR检验的规范化和标准化
上世纪90年代初期，PCR技术即由科研人员引入到国内，由于PCR技术简单方便，最初的PCR扩增+电泳的检测模式也使得相关试剂的研制没有任何技术难度，因此很快就有人将其用于临床诊断。在我国，人群的乙型肝炎病毒（Hepatitis
B virus,HBV）感染率高，自然而然最早用于临床检验的PCR项目就是HBV
DNA的检测，其后是性病病原体如沙眼衣原体和淋球菌，以及结核分枝杆菌等。一时之间，从事PCR试剂生产的小公司如雨后春笋般在全国各地不断冒出，大至三甲医院的临床实验室，小至个体诊所，很多的实验室都在开展PCR检验。但由于实验室设计的不规范、操作人员没有经过培训、试剂质量不过关，缺乏质量保证的意识和措施，假阳性和假阴性结果比比皆是，在临床产生了诸多医患纠纷，临床反映强烈，许多临床医生一谈到PCR，就给其戴上“结果不可靠的帽子”。
1998年3月卫生部临床检验中心受卫生部医政司委托，召集全国各地的有关专家，在北京召开了PCR临床诊断应用的有关问题的讨论会，综合专家的意见，鉴于当时的PCR检验的现状，会后不久，卫生部即发出《关于暂停临床基因扩增（PCR）检验的通知》（卫医发[1998]9号），暂停了PCR检验在临床上的应用。于是在很短的时间内，全国PCR试剂生产厂家迅速减少，临床实验室纷纷停止了PCR检验项目。
暂停临床PCR检验并不意味着PCR技术本身有什么问题，技术本身的成熟性是无可质疑的，问题在于其应用的不规范。因此，经过充分的讨论、修改，卫生部于2002年1月14日印发了《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）（以下简称《管理办法》），其后，卫生部临床检验中心（以下简称部中心）也下发了《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号），并编辑出版了实验室技术人员上岗培训统一教材《临床基因扩增检验技术》（人民卫生出版社，2002年8月）。上述文件的发布，要求凡是开展向患者收费的临床PCR检验项目的实验室，必须按照部发文件的要求进行分区设计，并根据所使用的具体试剂配备必要的检验仪器设备，人员必须经过卫生部临床检验中心或授权的省级临床检验中心组织的培训，持证上岗。除了这些硬件要求外，还要求实验室必须文件化的质量保证体系，以指导日常检验工作能高质量地完成。完成上述硬件和软件要求后，就要通过由卫生部临床检验中心和省级临床检验中心组织的专家组的技术验收，只有验收合格的实验室才能开展临床PCR检验项目。
为使技术验收规范有效地运行，卫生部临床检验中心起草了技术验收系列文件，即《临床基因扩增检验实验室技术验收申请表》和《临床基因扩增检验实验室技术验收报告》（内含技术验收表）等，技术验收表对实验室的设置、仪器设备配备、实验室环境设施、实验室内务管理、人员、仪器设备的使用维护和校准、临床标本的采集保存和处理、标本编号、检测操作、报告发放、实验记录的管理、投诉等进行逐条规定，其中心思想就是要求实验室除了在硬件上要满足开展临床检验项目的要求外，实验室还必须建立相应的质量保证体系，具体体现在各种程序文件的制定和实验记录的规范化和常规化等。
PCR实验室验收的模式为看、审、现场考试和现场实验等。看，主要是看实验室的分区设置、环境条件、通风、仪器设备配备和人员资质等是否符合部发文件的要求；审，主要是审核实验室制定的各项管理制度和程序文件是否具备及可操作性如何；现场考试，则以笔试或口试方式考核实验室技术人员是否知晓所制定的各项程序，并自觉应用；现场实验则是考察实验室是否按所制定的程序进行临床标本的检测、记录和报告，以及检测结果的正确性如何。
截止到目前为止，全国已通过技术验收的临床PCR实验室已超过1000家，分布于全国各级医疗机构、采供血机构和疾控部门的临床实验室，全国经过临床PCR检验上岗培训的实验室技术人员已接近上万人。全国临床PCR检验的质量得到显著改善和提高，并带动临床检验其他专业领域的规范化和标准化。
（二）临床PCR检验项目的开展
PCR在我国临床实验室主要是用于感染性疾病病原体的检测，其主要原因是这些病原体如乙型肝炎和丙型肝炎病毒、人类巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体、淋球菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体等，如采用以前的培养、免疫学方法测定特异抗原抗体、核酸杂交等进行临床检测，要么因为病原体难以培养，如上述病毒、细菌、衣原体和支原体的检测等，要么检测的灵敏度不够，如乙型肝炎、丙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒等的抗原抗体检测及核酸杂交检测等，而难以开展临床检测。PCR因其极高的检测灵敏度和特异性，使得血液、痰、尿液、粪便等临床标本中的极微量的难培养病原体的检测变得迅捷而又准确，甚至已成为目前大多数病毒、衣原体和支原体临床检测的首选方法乃至“金标准”。实时荧光PCR技术的出现，使得病毒载量的检测变得准确可靠，可很好地用于抗病毒疗效的判断，并且由于其对PCR实验室“污染”的减小，较之需要打开扩增反应管的PCR-杂交、PCR-测序、PCR-电泳等方法更具有临床实用性。PCR用于病原体感染的血液筛查，还可检出抗原抗体尚未出现的“窗口期”的感染，从而避免经输血感染性疾病的传播，发达国家、一些欠发达或发展中国家以及我国的个别血站均已常规将其用于血液筛查，大大提高了血液安全性。PCR用于病原体耐药突变的检测，如HBV、HIV-1等，使抗病毒药物治疗由以前的盲目变得明确而又有效。HBV、HCV的基因分型在临床治疗中有一定的应用价值；HPV基因型很多，特定基因型的检测对于判断感染的后果及采取相应对策有重要意义。目前，PCR-杂交或测序以及实时荧光PCR方法均已用于病毒的基因分型。
遗传病一般分为单基因、多基因及染色体遗传病。携带致遗传病基因者占总人口数的10％，人类遗传病通常是由于基因突变、基因缺失、染色体错位所致，有数千种之多，在我国常见的有地中海贫血、血友病和药物性耳聋等。在我国遗传病有较为显著的地域特点，如广东、广西、海南和四川等的地中海贫血。因此，遗传病的产前诊断在这些特定区域开展相对多一些。α地中海贫血的发生是由于α珠蛋白链基因突变的结果，α珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个α珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的α类基因或假基因。在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。β地中海贫血（简称β地贫）是由β珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11染色体短臂，总长度约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb.
β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种，其中在中国发现的有21种。血友病是一种X连锁隐性遗传病，分为血友病甲和血友病乙，几乎全部发生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致，而血友病乙则是因为缺乏凝血因子Ⅸ。控制产生凝血因子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色体上。氨基糖甙类抗生素所致的耳聋可分为两类：一类因接受了中毒剂量而致聋；另一类是有遗传背景，即带有线粒体125rRNA基因AI555G均质性点突变基因。由细胞线粒体的遗传基因发生变异之故。即家族的变异基因可能通过母亲遗传给她的子孙，使之具有潜在的过敏性，此称母系遗传。这些遗传病在以前常用的诊断方法有家系谱分析、染色体检查、生物化学分析等。采用PCR方法可在很短的时间内将靶DNA扩增数亿倍，再结合其他多种分子手段如探针杂交、限制性片段长度多态性分析、各种电泳、高效液相层析等已可检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等，故PCR方法已成为遗传病实验室诊断的最有效、最可靠的方法之一。但要注意的是，遗传病通常由于基因突变或缺失的位点较多，不同家系可能有不同的变异特点，故而需要具体家系具体分析，有时很难采用一种通用的突变或缺失检测试剂去检测所有的潜在变异，因此，遗传病的分子诊断通常需要临床医生及检验人员具有较全面的遗传学知识和专业技能，不能完全依赖商品试剂盒，需要实验室内自配试剂来解决检测的问题。
肿瘤是人类目前正全力寻找有效早期诊断和治疗方法的重大疾病之一。研究表明，其发生有内在的遗传因素，如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等均是已知的单基因遗传肿瘤。此外，几乎所有的肿瘤细胞中都有原癌基因的重排，导致细胞增殖与凋亡失控最终形成肿瘤。癌基因和抑癌基因及其状态的检测，在肿瘤的发生发展研究中已成为不可缺少的环节。在临床上，测定外周血和或骨髓免疫球蛋白重链（IgH）和κ链（Igκ）基因对扩散的大B细胞淋巴瘤有预后价值，可以对扩散的大B细胞淋巴瘤进行分子分期，并在分子水平确定具有正常骨髓组织学但五年生存率低的患者。白血病患者的治疗中,融合基因的检测对于疗效判断有重要意义。此外，特定肿瘤抗原的mRNA已成为癌转移发生的标志。同样，PCR-杂交或测序、实时荧光PCR等，在肿瘤基因有关的研究和检测中，已成为不可缺少的工具。目前国内已有少部分专业实验室在开展这方面的检测。
基于药物基因组学（pharmacogenomics）的个体化治疗现在已成为现实，细胞色素P450（Cytochrome
P450）基因型的不同，其对相应药物的代谢即有相当大的差异。细胞色素P4502D6（Cytochrome P450
2D6，CYP2D6）是细胞色素药物代谢酶由497个氨基酸组成，参与多种重要药物如多种抗心律失常药、β1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等的代谢。
CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的约1/3。CYP2D6的基因型的不同会导致患者药物代谢能力的很大差别。当患者的基因型为CYP2D6*1/*1时，为强代谢型（EM）；基因型是CYP2D6*1/*10时，为中等代谢型（IM）；CYP2D6*10/*10则为弱代谢型（PM）。在相同的美托洛尔用药的常规剂量（25mg/次，2次/d）下，EM者的推荐剂量为常规剂量的140%；IM推荐剂量为常规剂量的60%；PM者的推荐剂量则只有常规剂量的30%。华法林是临床上常用的抗凝药物，有很大的个体差异及种族差异，在不同的个体间用药剂量可以相差约20倍，其原因在于CYP2C9和
VKORC1基因变异。研究发现，携带其中至少1种基因变异的患者对华法林的反应更加敏感，因此美国FDA指南建议进行基因分型以指导华法林起始和维持治疗的最佳剂量。PCR-杂交或测序方法现已用于个体化治疗的细胞色素P450基因型检测，美国FDA也已批准相应的诊断试剂上市。目前在国内有少部分的实验室正在尝试这方面的检测。
DNA是遗传信息的物质基础，由遗传密码字母A、C、G和T的序列所决定。不同的个体，其每个细胞的染色体上的排列次序不同，从而使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基因组的核苷酸字母排列差异就越大。单基因座探针限制性片段长度多态性，称为DNA指纹，亦称为基因指纹。DNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。人的手指指纹可以消失或通过外科手术加以改变，而他的与生俱来的DNA则无法更改。当代法医学可通过对案发现场留下的血斑、精斑、毛发、组织碎片乃至微量残留细胞等，采用PCR序列分析方法来确定是谁所留，从而使得一根毛发、一滴血液、极小精斑、体液中的脱落细胞等成为分子物证，是以前的血清学方法（如血型鉴定）不可比拟的。目前，国内的司法部门均已采用该种分子物证手段来侦破案件。
二、PCR技术临床应用展望
PCR技术的最大特点就是能够不断的推出新的形式。最初的PCR是在变性、复性和延伸三个温度下30~40个循环后，将扩增产物进行电泳，在扩增时，特定的dNTP用放射性核素标记，电泳分离的产物进行放射自显影观察。后来，又根据双链DNA结合溴化乙锭并可在紫外光下发出荧光的原理，电泳后直接观察相应条带。但由于电泳后观察片段长短判断结果的方法，缺乏特异性，故而又出现电泳后，将条带转移至硝酸纤维素膜上，再用特异探针（放射性核素或非放射性核素标记）进行膜上杂交检测的Southern
印迹（Southern
Blot）试验。也可对PCR产物用特定的限制性内切酶进行酶切分析，即限制性片段长度多态性分析（RFLP），以保证检测的特异性。这些都属于定性PCR的范畴。采取上述模式，进行定性PCR测定非常简便，但进行定量PCR测定则较为困难。上世纪90年代中期出现的实时荧光PCR，使得通过PCR方法的定量测定变得简便易行，由于仪器能对整个扩增循环进行实时监测，不再需要额外的产物检测过程，因而不但操作简便，而且扩增产物的污染的可能性大大降低。此外，实时荧光PCR的测定范围和检测灵敏度也明显优于以前的检测方法。多个检测通道实时荧光PCR仪的出现，使得简便快速的多基因标志物同时检测逐步成为现实，疾病基因指纹的检测将不再是梦想。国内临床PCR检验也将从目前的以病原体检测项目占绝对主导地位，逐步向其他基因相关疾病如遗传基因相关的疾病、肿瘤、耐药性等的检测上拓展。
目前的临床PCR检验项目需要手工操作的是标本中核酸的提取，也是临床PCR检验最易致假阳性和假阴性的关键性环节，自动化核酸纯化仪的研制和临床实际应用，不但将上述因手工操作等人为因素所致的结果误差消除，也将大大提高临床PCR检验的准确性和重复性。除了仪器设备外，好的商品试剂盒或自配试剂是我们获得好的临床检验结果的必备武器。试剂方法的标准化，将使其用起来更为得心应手。
临床检验程序的标准化，将从源头减少误差产生的概率，各临床PCR检验项目标准物质的研制将为临床PCR检验的标准化提供有力的保证。
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