荧光定量PCR在中医药研究中的应用

摘要：荧光定量PCR是一种新的核酸定量技术，该技术在PCR仪反应系统中引入了荧光标记探针，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，从而具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了原有PCR仪技术的不足，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，扩大了PCR的应用范围，荧光定量PCR已广泛用于生物学及临床医学等多个领域，近年来其在中医药研究中得到越来越多的应用。 

　　关键词：荧光定量PCR;中医药;应用 
　　中图分类号：R2-03 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0758-03 
　　 
　　荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ PCR)，又称实时定量（real-time quantitative）PCR，FQ PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，1996年由美国Applied Biosystems公司首先推出。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。它的特点是：（1）用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。（2）荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。（3）进行实时动态连续的荧光检测，消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。与传统的PCR相比，实时定量PCR更加快速、灵敏，并能有效地减少试验过程中产生污染的危险[1]。 
　　荧光定量PCR的出现克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，使得PCR技术更广泛的应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面有着广阔的应用前景[2]。荧光定量PCR也越来越多地被应用于中医药的研究，为中医药理论及其临床研究提供了更为客观的物质基础。 
　　 
　　1荧光定量PCR在中医药防治乙肝中的应用 
　　 
　　1.1对乙肝的中医辨证分型客观化 量化的探索确定证型是中医辨证施治的前提，虽然对慢性乙肝的中医辨证分型已作了统一规范，但这些规范仍停留在传统的望、闻、问、切上，缺乏统一的量化和客观公认标准，给大规模的临床研究和实施循证医学带来许多困难。因此，探索慢性乙肝中医证型与客观监测指标间的关系，不仅是中医现代化的要求，也成为中西医结合的热点[3]。 
　　有学者观察慢性乙肝患者乙肝病毒（HBV）复制与中医证型关系，发现实证较虚证活跃，进一步研究发现慢性乙肝患者易发生HBV前C区突变，而以湿热中阻型乙肝易发生，脾肾阳虚型乙肝不易发生，表明实证者细胞免疫功能亢进。 
　　而另有人研究发现HBV-DNA按肝郁脾虚、湿热中阻、窍血阻络、肝肾阴虚依次递增。新近的研究表明，乙肝病毒可以分为A、B、C、D、E、F、G、H等若干基因型。在乙肝病毒治疗过程中，通常伴随着HBV病毒的基因型及血清学的转换。研究发现，基因型的分布与人群和地理位置有关。如在香港地区被证实属于B型或C型，而在瑞士主要为A型到E型以A型和D型最多。同时不同基因型的乙肝病毒对所用治疗药物的敏感性也有差异[3]。杨丽莎等[4]研究表明乙肝患者湿热滞留型HBV-DNA含量在5×106～5×109CPS/mL的浓度比例最多，正虚邪恋HBV-DNA含量在5×103～5×105CPS/mL的浓度比例最多，HBV-DNA含量低于湿热滞留，而高于无症状携带组，在乙肝病毒含量检测项目中异常变化顺序是湿热滞留>正虚邪恋>症状携带，可见病毒含量的浓度与湿热轻重密切相关，湿热含量越重者病毒含量越高。而徐秋英等[5]观察发现HBV-DNA按湿热中阻、肝肾阴虚、脾虚肝郁、脾肾阳虚、郁血阻络依次递减。 
　　根据以上发现，笔者在研究乙肝证型规范化时，若采用荧光定量PCR的方法，并结合乙肝的血清学标志及基因型标志，很可能对乙肝各证型的科学内涵做出更为明确的解释。 
　　1.2在乙肝的诊断和治疗中的价值中草药抗病毒作用众所周知，但由于酶免法检测乙肝标志物不能真实地反映患者体内乙肝病毒的复制情况，在观察乙型肝炎疗效方面缺乏量化的指标，而乙型肝炎荧光定量PCR检测可以对乙肝病毒的复制水平进行动态观察，根据患者血清HBV-DNA的拷贝数进行辨证分型，同时预测和评价中草药及干扰素的治疗效果，对临床有重要指导意义[5]。 
　　传统的酶免法检测乙肝病毒标志物检测的灵敏度一般需要105～7个病原体，荧光定量PCR检测的灵敏度则可达到0.01fg，相当于2.5个HBV-DNA颗粒。酶免法检测的是乙肝抗原抗体系统，在特异抗体产生之前，乙肝病毒就已出现在外周血中，但在血液中无法检测到，这样就出现了一个免疫学检测的“窗口期”问题，从而不能真实地反映患者体内乙肝病毒的复制情况。荧光定量PCR是直接从血液中检测乙肝病毒DNA，这就解决了免疫学检测的“窗口期”问题，从而判断疾病是否处于隐性或亚临床状态或者是现症感染还是既往感染[5]。 
　　在疗效观察上不能以单纯的HBeAg抗原的消失或临床症状的改善和消失为判定依据，在治疗的一些肝炎病例中，采用免疫测定法检测到HBsAg为阳性，而HBeAg为阴性者，不被确诊为乙肝活动期，预后也不存在转阴问题。然而患者的症状与乙型肝炎症状相似，通过中药治疗后患者大多数好转，有的甚至痊愈。究竟这些患者是否乙肝活动期、有没有HBV-DNA，经PCR检测发现，大多数HBeAg阴性携带者存在病毒复制具有传染性，因此，血清转化并不能说明HBV的消除及感染性的丧失。这也说明中药对乙肝有确切的疗效，它通过中和乙肝病毒，抑制其复制，并能及时清除抗原-抗体复合物，从而达到疏肝、清肝、泻肝、平肝、镇肝、养肝、柔肝、温肝的治疗作用[6]。

　　利用荧光定量PCR技术，可直接检测临床标本中的HBV-DNA存在的情况，这对确定患者血液的感染性，乙肝病毒持续感染中疾病的活动情况，进而采取相应的预防和治疗措施，以及对中药抗病毒药物疗效的评价，都具有非常重要的意义。 
　　 
　　2荧光定量PCR在评价中医药抗病毒疗效中的应用 
　　 
　　近些年越来越多的把荧光定量PCR运用于评价中药或复方在抗病毒方面作用的研究中，进一步地明确了中药的治疗效果和作用机制，使中医药的作用得到更为客观、定量的体现。 
　　范瑞强等[7]在探讨中药抗病毒胶囊治疗生殖器疱疹的研究中运用荧光定量PCR检测豚鼠生殖道单纯疱疹病毒（HSV）2型的含量，发现抗病毒胶囊可以减少脊髓神经节HSV-2DNA的含量。蔡有龄等[8]考察中药“疣毒清”对尖锐湿疣病毒（HPV）的杀灭作用发现，在提取的HPV中加入中药“疣毒清”后，在4℃下孵育，按时提取HPV-DNA，用荧光定量PCR法测定其病毒含量，经24h后即不能测出HPV，证实“疣毒清”具有明确的杀灭HPV的作用，找到了其在临床上单纯口服即能治愈尖锐湿疣且不再复发这一事实的机理。李芸茜等[9]探讨黄芪颗粒剂对刚地弓形虫RH株速殖子感染小鼠的治疗作用，用荧光定量PCR检测肝、肺弓形虫DNA基因拷贝数，通过比较各组小鼠的平均存活时间发现黄芪可以改善低剂量速殖子小鼠的存活情况。童光东等[10]通过对HBV转基因小鼠的实验观察，证明加味四逆散具有一定的抑制其血清中与肝组织中HBV-DNA的作用。吴建军等[11]研究双黄连粉针剂对人巨细胞病毒（HCMV）感染的小鼠肝组织病毒DNA载量的影响，实验表明双黄连能明显降低感染小鼠肝组织中病毒DNA载量，能减轻HCMV型肝炎模型鼠肝功能损害，改善肝脏病理变化。李薇等[12]探讨中药双黄连注射液对人胚脑单纯疱疹病毒Ⅰ型脑炎模型的抑毒作用，实验证实双黄连可通过减少病毒DNA的复制，对单纯疱疹病毒Ⅰ型脑膜炎模型的病变起到抑制病毒的作用。 
　　 
　　 
　　3荧光定量PCR在中医药引起基因表达变化作用中的应用 
　　 
　　俞建等[13]研究滋阴泻火中药对青春期大鼠中枢生长相关基因的影响，设立对照组，采用荧光定量PCR法，检测不同剂量中药对于青春期大鼠下丘脑及垂体部分生长相关基因的影响。结果滋阴泻火中药对于下丘脑促生长激素释放抑制激素(SRIH)基因表达，中、大剂量治疗组显著增高，表明其可能通过上调SRIH基因表达调节生长激素分泌，从而对青春期大鼠的生长发育起到一定的抑制影响。王琳等[14]应用实时定量荧光PCR方法研究复方861对人肝星状细胞（LX-2）中а-平滑肌肌动蛋白（а-SMA）基因表达的调节作用。结果表明，复方861在48和72h后可显著降低LX-2细胞中а-SMA mRNA含量，提示其抗纤维化作用可能与抑制LX-2细胞的活化有关。张黎等[15]研究何首乌水溶性成分2，3，5，4-四羟基二苯乙烯2-Ο-β-D葡糖苷（STI）对溶血磷脂酰胆碱(LPC)诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，用荧光定量PCR检测STI使VEGF mRNA表达成剂量依赖性降低，说明对其有明显抑制作用，基于VEGF与动脉粥样硬化的相关性，从而STI可能对动脉粥样硬化的预防及治疗有良好的开发前景。张荣华等[16]观察益骨胶囊预防和治疗用药对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织中的骨重建关键性转化生长因子（TGF-β）的影响，通过检测TGF-β1mRNA含量，在分子水平上阐明益骨胶囊防治骨质疏松症的可能作用机制，结果益骨胶囊能促进骨组织TGF-β1mRNA基因表达。张永芳等[17]探讨知母活性成分ZDY101对M2受体mRNA稳定性的调节，实验证实ZDY101能提高M2受体mRNA的稳定性，使细胞M2受体的mRNA含量升高，ZDY101可用于阿尔茨海默病的治疗。杨礼腾等[18]运用荧光定量PCR等研究表明，冬虫夏草的发酵粉末对肺纤维化胶原代谢有明显的调控作用，其作用机制可能为抑制转化生长因子TGF-β1mRNA表达的上调，从而干扰TGF-β-smads信号通路对靶基因的激活而实现的。朱昭明等[19]研究通肾络1号对高糖状态下大鼠肾系膜细胞金属蛋白酶2（MMP-2）及其抑制物2mRNA(TIMP-2mRNA)的影响，运用荧光定量PCR法及ELISA法检测MMP-2、TIMP-2mRNA转录水平及细胞培养上清产物FN、ColIV（二者为细胞外基质主要成分）的含量，结果表明通肾络1号可降低细胞上清FN、ColIV含量，这种作用是通过提高MMP-2mRNA水平，降低TIMP-2mRNA水平，达到升高MMP-2/ TIMP-2比值实现的。这一研究进一步明确了糖尿病肾病的发病机制及通肾络1号的治疗作用。 
　　 
　　4荧光定量PCR在舌诊研究中的应用 
　　 
　　许冬青等[20]采用基因芯片及实时定量PCR技术研究舌癌患者不同舌苔舌背黏膜上皮细胞表皮。生长因子受体（EGF-R）表达的差异，以期从基因分子水平探讨不同舌苔形成机理，为中医诊断现代化提供实验依据。结果表明，不同舌苔上皮细胞EGF-R基因表达水平存在明显差异，EGF-R可能是影响舌苔形成的重要因素之一。已有报道，不同舌苔的形成与舌上皮细胞凋亡基因的表达及细胞生化代谢等有关，说明舌苔变化可能是多基因联合调控的结果，其机制有待于进一步深入研究。 
　　 
　　5结语 
　　 
　　综上所述，荧光定量PCR作为一种新的核酸定量技术，在以前的PCR技术基础上得到进一步发展，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，而且不必使用对人体有害的染色剂。在中医药迫切需要得到进一步发展的今天，荧光定量PCR技术已越来越多在中医药研究中得到应用，除上述应用外，荧光定量PCR还可进一步运用于对中医证实质的研究及构建中医证的相关基因表达图谱，用于探讨中医经络现象和针灸的作用机理以及对中药材进行分子生物学检测，荧光定量PCR必将不断扩大其应用领域。随着PCR技术在中医药研究中的广泛应用，它将极大的促进中医药的发展，为中医学走向世界、走向现代化作出贡献。

　　参考文献 
　　［1］蔡霞.定量PCR技术及其应用现状［J］.现代诊断与治疗，2005，16（2）：112-115. 
　　［2］邓少丽，罗阳，陈伟.荧光定量PCR技术及其在临床上的应用［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23（5）：301-303. 
　　［3］韩凌，韩冰，舒彤.荧光定量PCR技术检测乙肝患者HBV-DNA的临床意义及其用于中医药预防乙型肝炎的思考［J］.中国中医药信息杂志，2005，12（12）：95-97. 
　　［4］杨丽莎，蒋就喜，陈廷生，等.乙肝病毒DNA含量与中医辨证的研究［J］.四川中医，2000，18（8）：14-16. 
　　［5］徐秋英，彭胜权，刘亚敏，等.荧光定量PCR技术在评价中医药治疗乙型肝炎中的价值［J］.新中医，2002，34（10）：71-72. 
　　［6］徐莉，潘玉贞，邓鲁明. PCR技术及其在中医药研究中的应用［J］.中医药学报，1997，3：8-9. 
　　［7］范瑞强，李红毅，禤国维，等.中药抗病毒胶囊对豚鼠生殖器疱疹模型神经节及大脑影响的电镜和定量PCR研究［J］.岭南皮肤性病科杂志， 2001，8（1）：8-10. 
　　［8］蔡有龄，谭淑珍，吴燕.中药“疣毒清”（Verrucout）对尖锐湿疣病毒（HP V）杀灭作用的实验研究［J］.中国性病艾滋病防治，2002，8（2）：108-109. 
　　［9］李芸茜，黄佩君，王祝鸣，等.黄芪对急性弓形虫RH株感染小鼠的保护作用研究［J］.中国血吸虫病防治杂志，2004，16（2）：129-132. 
　　［10］童光东，周大桥，刘惠玲，等.加味四逆散抑制HBV转基因小鼠HBV实验研究［J］.中西医结合肝病杂志，2004，14（2）：85-88. 
　　［11］吴建军，刘贵育，陈贵海，等.双黄连对人巨细胞病毒感染小鼠肝组织病毒DNA载量影响［J］.中国药理学通报，2005，21（5）：621-624. 
　　［12］李薇，蒋丽敏，郭岩，等.中药双黄连对单纯疱疹病毒的抑毒作用［J］.中国现代医学杂志，2006，16（3）：378-380. 
　　［13］俞建，吴家敏，杨毅，等.滋阴泻火中药对大鼠中枢生长相关基因的影响［J］.中国医药学报，2004，19（1）：15-17. 
　　［14］王琳，王宝恩，肖培根，等.复方861对人肝星状细胞а-平滑肌肌动蛋白mRNA表达的调节作用［J］.中草药，2004，35（10）：1147-1150. 
　　［15］张黎，芮耀诚，丘彦，等.首乌水溶性成分2，3，5，4-四羟基二苯乙烯2-Ο-β-D葡糖苷（STI）对内皮细胞表达VEGF的影响［J］.药学学报，2004，39（6）：406-409. 
　　［16］张荣华，杨丽，朱晓锋，等.益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织TGF-β1mRNA基因表达的影响［J］.中药材，2005，28（4）：312-315. 
　　［17］张永芳，胡雅儿，夏宗勤.知母活性成分ZDY101对M2受体mRNA稳定性的研究［J］.上海第二医科大学学报，2005，25（4）：368-381. 
　　［18］杨礼腾，程德云，聂莉，等.虫草菌粉对肺纤维化大鼠肺TGF-β1及其信号通路分子mRNA表达的影响［J］ .四川中医，2006，24（2）：23-25. 
　　［19］朱昭明，杨素琴，吴以岭.通肾络1号对高糖状态下大鼠肾系膜细胞金属蛋白酶2及其抑制物2mRNA影响的研究［J］.中国中医基础学杂志，2006，12（2）：121-123. 
　　［20］许冬青，佟书娟，詹瑧.表皮生长因子受体在舌癌患者常见舌苔中的表达［J］.上海中医药大学学报，2007，21（1）：47-49.