目的
对于许多重组DNA的实验，知道DNA的序列常是进一步操作所必备的。 本实验将定出你所选殖之cDNA的序列，并进行数据库比对分析。其目的在教导学生如何从事DNA定序分析及DNA序列的计算机分析。
原理
本实验所使用之方法为F. Sanger所发展之dideoxy定序法。 此法乃是将一引子黏合到欲定序之DNA模板上，再利用DNA聚合脢行聚合反应，直到加入一dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)而中断。 每一定序分析须执行四组反应，每一反应含有所有四种deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)及限量之一种ddNTP。 由于ddNTP缺少核酸链聚合所需之3’-OH基，四组反应中的核酸链将会分别停在A、 G、 C或T。 dNTP和ddNTP的相对浓度可调整至所产生中断链的长度范围从数十到数百个核甘酸。然后，利用高解析力之定序胶体电泳将四组反应产生之DNA片段依长度大小分开，即可读出DNA序列。
材料
RNase A：10 mg/ml水溶液。
30% polyethylene glycol (PEG) 6000/1.5 M NaCl
2 M NaOH/2 mM EDTA
3M sodium acetate (pH 5.3)
下列试剂来自United States Biochemical公司所售之Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit：
o Sequenase Reaction Buffer (5X concentrate)：200 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，250 mM NaCl
o pUC/M13 forward (-47) primer： 5'-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3'
o 四种Termination Mix： 均含50 mM NaCl，80 M dATP，80 M dGTP，80 M dCTP，80 M dTTP，并各含8 M ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP
o 0.1 M dithiothreitol(DTT)
o Labeling Mix (5X concentrate)： 7.5 M dGTP，7.5 M dCTP，7.5 M dTTP
o Enzyme Dilution Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM DTT，0.5 mg/ml BSA
o Sequenase Version 2.0 T7 DNA polymerase：13 units/l in 20 mM KPO4 (pH7.4)，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% glycerol
o Stop Solution： 95% formamide，20 mM EDTA，0.05% bromophenol blue，0.05% xylene cyanol FF
10 mCi/ml [35S]dATP：购自Amersham公司
40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液
urea
10X TBE buffer：890 Mm Tris-borate，890 mM boric acid，20 mM EDTA
10% ammonium persulfate
TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)
X光片：Kodak公司之BioMax MR
操作步骤
1. 欲定序之模板DNA的准备： 你已将前面实验所选殖之cDNA送入pGEM-T Easy载体内，并已少量制备此质体DNA。 取1-2 g DNA (溶于30 l TE)，加入RNase A 使其最终浓度为20 /ml，于37 oC作用15分钟。 加入10 l 30% PEG-6000/1.5M NaCl剧烈震荡后，置于冰上60分钟。 再于4oC 12,000 g离心10分钟。倒掉上清液，用1 ml 70% ethanol清洗，于12,000 g离心3分钟，倒掉上清液。 再用1 ml 95% ethanol清洗，于12,000 g离心3分钟，倒掉上清液。 真空抽干后，以10 l TE回溶DNA沈淀。
2. 加入1 l 2 M NaOH/2 mM EDTA到步骤1之DNA溶液内，于37 oC作用30分钟，使DNA变性。 然后加入1 l 3M sodium acetate (pH 5.3)以中和溶液。 再加入30 l 95% ethanol将DNA沈淀，置于-70 oC 15分钟，于4oC 12,000 g离心10分钟。 倒掉上清液，用1 ml 70% ethanol清洗，于12,000 g离心3分钟，倒掉上清液。 真空抽干后，回溶在7 l蒸馏水中。
3. 加入2 l Sequenase Reaction Buffer及1 l primer到步骤2之DNA溶液内，混和后，加热至65 oC作用2分钟。 再于室温自然冷却至低于35 oC，以进行DNA与引子的黏和作用，其冷却时间需大于30分钟。
4. 在等待DNA溶液冷却的时候，取四根微量离心管分别标识为A, G, T, C，并分别加入2.5 l内含ddATP，ddGTP，ddTTP或ddCTP之Termination Mix。 置于室温下，等待以下之步骤5。
5. 加入下列物质至在已冷却之DNA溶液中：1 l 0.1 M dithiothreitol，2 l 1X Labeling Mix，0.5 l 10 mCi/ml [35S]dATP及2 l Sequenase稀释液(1:8稀释于Enzyme Dilution Buffer)。 置于室温2-5分钟，各取3 l放入步骤4内含2.5 l Termination Mix之微量离心管中。 于37 oC作用5分钟后，各加入4 l Stop Solution。
6. 定序胶体之制备：混合下列试剂于三角椎瓶中：9 ml 40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液，25.2 g urea，6 ml 10X TBE buffer，约10 ml去离子水。 置于热板上加热使urea溶解，加水至总体积为60 ml，过滤去除不溶之杂质，再抽气除去溶液内之气体。 最后，加入300 l 10% ammonium persulfate及30 l TEMED，混合后立即倒入预先装置好之两片玻璃板间，若有气泡则轻敲玻璃赶出。插上齿梳后等待胶体凝聚，此为含7 M urea之6% polyacrylamide定序胶体。
7. 将电源供应器(GIBCO BRL model 4000)设定最大电力为1900 V，70 W，100 mA，预热胶体约30分钟。 将已完成定序反应之DNA样品加热至75 oC作用2分钟，取3 l加载胶体作电泳分离。 适当时间后，取下胶体，贴于Whatman 3MM滤纸上并盖上保鲜膜。再置于胶体干燥器(gel dryer; Model AE-3750, Atto Corporation, Japan)，于80 oC真空干燥 1小时后，置于片夹内压上X光片2-3天，再显影以分析DNA序列。
结果及讨论
1. 读出你所选殖之cDNA的序列，并尝试将核酸序列转译为埯基酸序列。
2. 将DNA及蛋白质序列与数据库(如GenBank, EMBO)内已知之序列作比对，以判别其为未知序列、已知序列、或与已知序列类似之序列。此等讯息将有助于进一步对其功能之探讨。
3. 其它你认为值得讨论之发现。
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