如何做出一张合格的组织切片？
一般要先取材→固定→透明→包埋→切片，最后进行染色组化等操作。本文着重叙述取材以后如何进行包埋和切片。
包埋可分为OCT包埋（冰冻切片）与石蜡包埋。
冰冻切片对于组织的抗原性保留比较好，但是形态保留比较差，一般用来做原位杂交ISH，免疫荧光IF。冰冻切片较厚一般厚度8~15μm。冰冻包埋步骤较为简洁，固定之后，直接用镊子将样品放置到样品托上，挤压OCT完全包裹组织，放入冷冻机待OCT凝固即可。凝固后就可以直接切片。如果不能及时切片，用锡箔纸包装好，放入-80℃存放。
石蜡切片，一般用来做HE染色或者免疫组织化学IHC。厚度更薄，一般为4um，工艺较为复杂并且制作样本的好坏取决于不同组织的种类和组成，更加依赖制作者的经验，需要在实验过程中不断优化才能得到最佳的实验条件。
下面是石蜡包埋和切片的具体步骤：
一、实验材料
动物组织，4%多聚甲醛（PFA），PBS，ddH2O，二甲苯，梯度乙醇，石蜡，石蜡包埋机。
二、实验步骤
1、取材：针对各组织部位规范化取新鲜组织，并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块，不要超过5mm。
2、固定：将切好的组织块放入4%多聚甲醛（PFA）中固定，以组织块与4%多聚甲醛体积比 1：7为宜。PFA最好现用现配，一般在4度固定24~48h即可，固定时间因组织而异。冰冻切片可以直接用丙酮固定。其他固定液比如缓冲福尔马林PBS配的福尔马林含有K+和Na+，PH=7.4。
固定的原理是采用蛋白质凝固剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。
3、洗去PFA：固定完毕后，流水冲洗3次，每次5分钟。
4、脱水透明：此步骤应根据不同组织设置合适时间，基本流程如下
脱水：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇（关键步骤：可当日2H也可过夜）→95%乙醇1→95%乙醇2→无水乙醇
根据不同组织大小和类型调整脱水时间，对于小鼠肝组织95%乙醇控制在30min-1H，100%乙醇5min-30min。
透明：50%乙醇+50%二甲苯→二甲苯1→二甲苯2→二甲苯3
利用透明剂即可以和脱水剂相混合又能和石蜡相混合的特性，可以将脱水剂替换出来，并引入石蜡到组织中。二甲苯易挥发并且有毒，该步骤在通风橱中进行。
透明过程中及时观察组织形态调整透明时间，在光照下观察组织是否透明成功，透明适度即可，一般透明时间约为5min-30min。透明后放入小塑料盒子里做好标记。
5、浸蜡：将石蜡融化，温度保持在55℃左右。一共需要过三遍蜡。因第一次组织含二甲苯过多，第一次浸蜡时间尽可能短约15分钟，后两次可适当延长至30min-1h。该步骤的蜡纯度质量要求不高，但是要注意该步骤石蜡的熔点为54-56℃。
6、包埋：将组织块放入盛有蜡液的模具中，所需组织切面与底部平行，因蜡液在冷环境中易凝固，此步尽量要快。包埋用的石蜡因为要用于切片，对其质量和纯度和硬度的要求比较高，一般采用徕卡高熔点58-60℃的片状石蜡。
包埋在包埋机上进行，包埋机有60℃的工作台和-10℃的工作台，顶部是融化后的徕卡高级石蜡，从出蜡头按压出蜡。
取一个金属槽子，加入一些石蜡，然后用镊子将组织固定好，移动到-10℃的台子上，石蜡很快凝固，组织就固定在里面了，最后盖上做好标记的盖子。放在冷冻台上，约半小时后可以把铁槽取下来。
蜡液凝固虽然很快，但是刚凝固的蜡不好切，最好在四度冰箱放置过夜后再进行切片。蜡块可在4度储存很久。
7、切片：不同组织厚度参考：肝肺心：4-6um，常规：4um，淋巴结，肾：2um。
刀片锋利，使用时千万小心，日本产feather R35刀片是病理学老师推荐的最好用的刀片，但是单价十分昂贵720一盒，一盒50片。
注意事项：软组织冰冻一下再切，硬组织加热后再切。
石蜡切片要点和对策，戳这里[2]：
8、展片：切好的片段用毛笔小心转移到38-40℃的展片台内的清水上，待几分钟后切片完全没有褶皱，选择组织形状完整并且没有刀痕的片子进行捞片，一个片子可以捞上两片。使用黏附载玻片，吸附能力更强。
9、烤片：放入60度烘箱内烤片，烤片过夜，取出后常温保存备用。
三、注意事项
1、组织一定要新鲜，冻过的组织最好不要用来包埋，因为组织结构可能改变。如果进行短途运输，干冰比液氮更合适。
2、组织块可根据组织特性调整大小。
3、切组织块时刀片一定要锋利，及时更换并且单方向切，防止损坏组织。
4、固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几时小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。
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