多重PCR核酸检测

一般的PCR反应仅应用一对引物，通过PCR扩增对单个基因序列进行复制，主要用于单一靶标的检测。多重PCR（Multiplex PCR），是在同一PCR反应体系里加上两对或以上的引物，同时进行多个基因的扩增检测。

多重PCR反应最常见的类型是双重反应。在一定情况下，为了能够同时检测多个靶标基因，多于双重的反应也是可以实现的，但是需要更多的设计与验证工作来保证多重反应体系的稳定性。

多重PCR核酸检测主要用于样本中单个病原体的多个靶标、多种病原体或多个突变位点的联合检测，针对一个样本单次测试可以给出更多检测指标，为临床提供更多检测信息。

多重PCR技术具备单个反应体系检测多种靶标的能力，但是如果需要鉴别反应体系中的不同靶标基因，则需要针对不同的靶标，设计特异性的探针并标记荧光基团，不同的靶标标记不同的荧光基团。为了避免荧光基团之间的相互干扰，应合理选择不同光谱范围的荧光基团。荧光基团应与使用的荧光定量PCR仪器具有适配性，每个荧光通道进行单个靶标基因的读取。考虑到PCR仪荧光串扰问题以及反应体系中引物探针互相的干扰作用，目前市面上的PCR仪最多支持4个通道检测，即单管鉴别4个靶标基因。

如何突破多重PCR技术瓶颈，破解单通道只能鉴别单个靶标基因的难题？一种基于荧光定量PCR平台的新型多重荧光PCR技术被开发并获得了国家知识产权局颁发的发明ZL证书。该方法将传统的实时荧光定量PCR法与PCR熔解曲线法相结合，在同一个荧光通道，针对一个靶标基因设计特异性引物以及特异性荧光探针，另一个靶标基因采用ZL特殊的寡聚核苷酸修饰技术。从而实现在一个荧光通道中进行多个靶点的同时检测，极大地增加了常规荧光PCR仪器的检测通量，为临床的多病原体检测提供更为有力的工具。

多重PCR技术更多的时候用于单个病原体的检测，其中包括“内标+靶标基因”与“内标+多个靶标基因”的组合方法。试剂盒中添加内标，可使结果更加准确可靠，避免因试剂操作过程出现的假阴性。圣湘生物是“内标法”的国内率先应用者。

多家企业针对本次疫情开发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒就属于“内标+多个靶标基因”的多重PCR技术。国家卫健委印发的最新版《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》，推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针设计核酸检测试剂盒。从《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》中可以看出，大部分厂家为双靶标检测试剂，仅有一家为单靶标试剂。同时针对两个靶标的检测试剂，可以最大程度保证检测的特异性并避免漏检的发生。

本次新冠疫情防控工作中，多次强调了呼吸道病原体鉴别检测的重要性。近期，圣湘生物利用多重PCR技术开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒、乙型流感病毒多重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)已获得欧盟认证机构颁发的CE认证证书。另外，还有六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒以及七项呼吸道病原菌核酸检测试剂盒，进行常见呼吸道感染相关病原体的检测与鉴别。

多重PCR技术在多种病原体检测应用中具有三大特点：

①高效性：同一PCR反应管中可同时检测多个病原体基因。

②系统性：对引起相同或类似症状疾病的不同病原微生物或具有相同感染途径的多种病原体等进行检测或鉴别。例如引起呼吸道疾病的病原体；通过血液传播的感染性病原体；导至脑炎脑膜炎症候群相关病原体等，都可使用多重PCR技术进行组合检测与鉴别。

③经济性：相较于多个病原体逐一进行单重检测，多种病原体在同一反应管内进行检测使用的样本量与试剂更少，操作步骤也更少。

准确快速的多重病原体检测可以及时对不同病原体感染进行区分，进而指导临床医生采取合理的治疗措施，大大缩短了合并感染者的诊断时间，减少医务工作者的工作量及医疗资源的浪费。在疫情防控工作中做到争分夺秒，充分发挥技术价值。

基于多重PCR技术开发的检测试剂广泛用于日常临床实验室，单独或联合检测各种病原体的感染，具有检测简单、敏感性高、特异性强、快速且成本低等优点，对临床精准诊疗具有重大意义。