高效液相色谱法对主成分及杂质的定性定量分析的前提是色谱峰为单一流出峰，如有共流出物的存在，会直接导致分析方法验证的失败，故一般在分析方法开发初期即需对目标色谱峰是否为单一峰进行检查。采用DAD检测器可以对各成分的光谱纯度进行分析，结合其他分析手段可确认主成分色谱峰的纯度。然而在用DAD检测器进行峰纯度检查时，往往出现明显存在杂质峰，峰纯度检查却显示通过或已确认为单一峰，可峰纯度检查却无法通过的现象。此时，须对可能影响DAD检测器纯度检查的因素进行排查，以便对结果做出正确的判断。DAD检测器进行纯度检查的基础是各成分间紫外光谱存在差异，但也会有杂质与主成分的紫外光谱无明显差异或完全一致的情况，这种情况下用DAD进行色谱峰纯度检查就无能为力了。
一 工作原理
关于色谱峰纯度的原理，工作站依据光谱匹配度来衡量峰纯度，光谱可以用来表征化合物分子结构特征，在进行峰纯度检测时，工作站会将被检测峰上采集的所有光谱做归一化处理，然后比较光谱的匹配性。如果一个色谱峰中只含有一种组分(峰纯度很好)，峰上各个时间点采集到的光谱的外形几乎是一致的，做归一化处理后所有的光谱几乎一样的，如果所有的光谱一模一样，则匹配因子将达到1000(100%匹配)；如果一个色谱峰含有多种组分，只要组分间的光谱有差异，当将峰上每个采集时刻的光谱做归一化处理之后匹配度自然很差。峰纯度的阈值相当于一个衡量标准，能影响到峰纯度检测直接给出的结果，我们可以选择由工作站来计算阈值(工作站根据被检测峰的信噪比计算，因此每个峰给出的阈值会略有不同)，也可以自行设定固定阈值，推荐值是990(相当于99%相似)。
二 峰纯度测定步骤
以安捷伦高效液相色谱仪为例，仅供大家参考
a.设置纯度检测阈值
点击Spectra(光谱)菜单下的Spectra Options(光谱选项)，在光谱选项窗口点击Purity(纯度)，或选择Calculate Threshold(计算阈值)，或选择Fixed Threshold(固定阈值)，建议选择计算阈值，如果纯度检测结果显示的计算阈值过小再考虑设置固定阈值，推荐的固定阈值是990。
b.调用数据文件
注意，如果要使用峰纯度检测功能，采集数据之前一定要在DAD参数设置窗口选择保存全部光谱(英文工作站选择All)。
c.将光标切换到峰纯度检测状态
点击Spectra(光谱)菜单下的Select Peak Purity(选择峰纯度)，光标即变为峰纯度检测状态，点击要检测的色谱峰即可得到结果。
d.峰纯度的结果
在右下方的窗口中可以看到色谱峰、阈值曲线和相似度曲线，相似度曲线对应的点低于阈值曲线即表明没有超出阈值
可以点击峰纯度信息快捷键(如下图)，查看当前的Purity factor(峰纯度因子)和Threshold(阈值)。
三 利用光谱进行纯度检测的局限性
高效液相色谱法定性定量的前提是色谱峰由单一组分构成，因此色谱峰的纯度，即一个色谱峰究竟是由一种组分构成，还是包含了两种或者两种以上的成分成为人们首先关心的问题。二极管阵列检测器（DAD）的开发是过去20年内高效液相色谱技术的重要进步，它用于研究及日常分析可提供最佳波长的确定、峰纯度判别以及色谱峰的定性功能。DAD检测器可以得到任何一时刻各个波长下的吸光度值，即可以得到样品在各个时刻的吸收光谱图。
使用这些方法判别峰纯度时都要求待测组分色谱峰中共洗脱杂质的紫外光谱明显不用于主组分的紫外光谱。光谱间的差异越大，对于共洗脱杂质的检测限就越低。然而，有机物的紫外光谱一般均显示曲线变化不明显的宽带，缺乏能够说明细微差别的精细结构，尤其是对于那些生色团相同，而结构上的差异部分由于生色团不同的化合物间的结构差异不能够给予足够的描述。实际上许多情况下，例如同分异构体的杂质和主组分的降解或代谢产物与主组分在结构上是非常相似的，这时利用组分的紫外光谱信息判别色谱峰纯度就会遇到不能检测到分析物的共洗脱杂质的情况，甚至有时候会给出完全错误的峰纯度结果，从而给下一步的定性定量分析带来很大的误差。
其局限性主要总结如下：
1、当我们用普通的C18柱(而非手性柱)分析手性样品时，纯度检测就无能为力了，手性组分中不同消旋体之间的光谱是一致的；
2、 如果混合物中组分间的光谱类似，而各组分在色谱柱上的扩散程度也几乎一致(完全没有分开)，各个时间点采集到的混合光谱几乎是一致的，也会得到很高的纯度匹配因子；
3、另外当被检测峰的浓度很高时，会导致尤其是峰顶点处的光谱由于浓度高而变形，即便是纯的组分也很可能得到很低的纯度因子；
4、如果采集的光谱较少，则纯度检测的结果基本上是不可靠的，假设峰上只采集了一张光谱，即便是混合物，纯度因子却能达到1000。
总结看来，峰纯度功能可以给出否定的答案(色谱峰是混合物)，很难给出肯定的答案(色谱峰是纯的)，只能说可能是纯的，此时峰纯度信息仅作为参考信息。
四 结语
DAD或PDA配合数据处理系统，给出的色谱峰纯度结果，理论上讲，只是参考值。如对于对映异构体来说，同一对对映异构体之间互为手性杂质，但他们却具有完全一致的光谱形状和吸光特点，而且在非手性分离条件下，出峰位置完全一致，此时检测器的色谱峰纯度检测功能就不能检测到该手性杂质。甚至在手性环境下，对映异构体之间已经实现了部分分离的时候，理论上讲，色谱峰纯度检测功能依然无法将其分别判定为杂质。
对于完全没有分开的两个色谱峰进行色谱峰纯度检测的时候，由于两个色谱峰完全重叠，任意一个时刻的光谱图均是两个洗脱组分的吸收光谱图叠加之后的结果，在这种情况下，色谱峰纯度检测功能也无法判断出该色谱峰是不纯的。
因此，对于可能存在于主组分结构相似的杂质的样品体现的液相色谱分析方法，峰纯度的可靠评价最好是通过收集色谱峰流出液，然后更换不同的色谱体系或者是由对微小结构差异灵敏的质谱等手段来验证。
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