分析测试百科网

搜索

喜欢作者

微信支付微信支付
×

盘点:分子诊断常用技术(一)

2021.7.05
头像

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

分子诊断技术即是利用分子生物学方法对人类及病原体的各类遗传物质进行检测,以帮助对疾病进行诊断。以技术原理出发对分子诊断技术进行归类与评价,以对目前临床常用技术的沿革进行回顾。

1961年Hall 建立的液相分子杂交法标志着人类掌握分子生物学技术对特定核酸序列进行检测,开启了对疾病分子诊断的大门。1983年Mullis提出的聚合酶链反应( PCR) 概念,更是给分子诊断技术插上了基因扩增的翅膀,大大提高了基因检测技术的敏感度与特异性,降低了分子诊断的技术门槛。按照检测的原理对半个世纪中临床常用的分子诊断方法进行归类,以分子杂交、核酸序列测定、分子构象变异与定量PCR4大类对其历史沿革、技术原理与实践应用进行简要的介绍与评论,以更好的回顾过去,展望分子诊断领域的未来。

一、基于分子杂交的分子诊断技术

上世纪60 年代至80 年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20 年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

( 一 ) DNA 印迹技术( Southernblot)

Southern于1975 年发明了DNA 印迹技术,通过限制性内切酶将DNA 片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA 片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA 变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA 片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA 片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性( restriction fragmentlength polymorphism,RFLP) 的鉴定中。Alwine 等于1977 年推出基于转印杂交的Northern blot 技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

( 二 ) ASO 反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980 年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA 印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针( allele-specificoligonucleotide,ASO) ,更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986 年,Saiki首次将PCR 的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR 扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA 的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

( 三 ) 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH 源于以核素标记的原位杂交技术, 1977年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪80 ~ 90 年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH 推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH 结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列; 由于使用高能量荧光素标记的DNA 探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。如今,FISH 已在染色体核型分析,基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交( comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析( spectral karyotyping,SKY) 等FISH 衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

(四) 多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)

MLPA 技术于2002 年由Schouten 等首先报道。每个MLPA 探针包括2 个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13 噬菌体衍生法制备; 每个探针都包括1 段引物序列和1 段特异性序列。在MLPA 反应中,2 个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2 部分探针。连接反应高度特异,只有当2 个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1 条完整的核酸单链; 反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1 个碱基的差别,就会导致杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1 对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1 次反应中对45 个靶序列的拷贝数进行鉴定。

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland 公司10 余年的发展,MLPA 技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA 甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。


互联网
文章推荐