细胞培养箱内的支原体怎么检测

可用直接培养法检测细胞培养箱内的支原体污染。
培养基准备： 基本配方为Difco PPLO broth（60%），马血清（20%），15%酵母膏溶液（10%），10x储存液（10%）。由于培养时间长，可加50u/ml青霉素至10x储存液 或加入乙酸铊（1：2000）至培养基中以防止其他细菌的污染。 10x储存液（1升）： 称取50克葡萄糖，10克L-盐酸精氨酸溶于1升蒸馏水中。用0.22μm无菌过滤膜过滤除菌，分装100ml至瓶中，-70℃保存。 液体培养基（1升）： 称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解。灭菌121℃15分钟灭菌。待温度降低至室温后于无菌操作台内加入200ml马血 清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解冻的10x储存液，混合均匀后分装至已灭菌的有盖螺旋试管中，10ml/管。4℃保存，保存期限为1个月。 固体培养基： 称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红，15克Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解。121℃15分钟灭菌，放入50℃水浴中，待温度降至50℃时于无菌超净台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及解冻的10x储存液，混合均匀后倒入60x15mm无菌培养皿中，5ml/皿。保存于4℃，期限为1个月。 步骤：取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液接种于液体培养基中，置于37℃培养2周，观察是否有浑浊或pH变化。培养一 周及两周后，分别取0.1ml液体培养液涂于琼脂平板上，倒置于厌氧缸中，37℃培养至少3周，持续观察是否有支原体菌落出现。另取1ml细胞培养液或 0.2ml细胞悬浮液涂于琼脂平板上，37℃厌氧培养3周，持续观察是否有支原体菌落出现。另作正负对照组，正对照为Acholeplasma laidlawii（ATCC 23206）与M. arginini（ATCC 23838）。负对照组为待测细胞的新鲜培养液。 结果判断：支原体生长较慢，所以先在液体培养基中培养1-2周增殖后再培养于琼脂平板上，至少培养3周后才能断定是否有支原体 污染。所以总个测试要5周才知道正确结果。典型的支原体菌落是荷包蛋形，是由于支原体网琼脂下层生长所致，为无色透明菌落，大小约为10-55μm 。但是并非所有支原体都是荷包蛋菌落，有些是圆形或类似黏菌类形态。区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自琼脂平板上切下，重新培养于液体培养基中， 培养一周后再接种入琼脂平板，细胞和菌落则不会生长。