钙成像能够以单细胞分辨率并行记录活体动物的神经活动，为破解神经回路中信息的传播、整合和计算机制提供了可能。为了进行准确的神经功能分析，获取高信噪比的钙成像数据尤其关键。然而，由于在体钙瞬变（Calcium transient）的低峰值积累和快速动态特性【1,2】，使得探测器无法捕捉足够多的荧光光子，一直以来难以突破光的量子本质所导致的泊松噪声极限。钙成像信噪比过低的问题长期困扰着神经科学家，现有方法不得不通过牺牲成像速度、分辨率或者组织活性来换取图像信噪比，而极大地限制了生命科学的发展。
2021年8月16日，Nature Methods杂志在线发表了清华大学脑与认知科学研究院、自动化系戴琼海课题组题为 Reinforcing neuron extraction and spike inference in calcium imaging using deep self-supervised denoising 的研究论文。该论文提出一种用于钙成像去噪的自监督学习方法（DeepCAD），仅使用单个低信噪比的钙成像视频序列即可实现网络训练。
由于神经元钙活动的高速、非重复特性，传统监督学习所必需的训练真值无法获取，该自监督学习策略打破了对训练真值的依赖，在钙成像去噪方面取得突破。在此基础上，DeepCAD使用三维网络结构充分利用神经活动的时空相关性，将钙成像信噪比提升十倍以上，克服了光子噪声极限。该方法被用于观测小鼠大脑皮层神经纤维网和神经元群落的钙动态，实现了低激发功率下的高信噪比钙成像，并可广泛适用于各类钙成像系统。
图1. DeepCAD原理与应用示意图
为了验证该方法的准确性和可靠性，作者搭建了一套特殊的双光子显微镜，样本所发出的荧光光子在探测端被分光设备分为1:10的两部分，两路信号同步采集。低信噪比的图像作为原始数据输入网络，高信噪比的图像用于验证输出的结果。DeepCAD首先应用于小鼠大脑皮层Layer 1神经纤维网的钙成像去噪，结果表明，去噪后的数据信噪比提升超过十倍，原本淹没在噪声中的钙活动可以被真实地恢复出来。
图2. DeepCAD恢复淹没在噪声中的神经纤维网钙动态，信噪比提升十倍以上
DeepCAD同样被应用于观测小鼠大脑皮层Layer2/3神经群落的钙活动。去噪之后的钙成像数据具有非常高的信噪比，仅从单帧图像就能清晰辨认出神经元的形态和分布。由于有效去除了探测噪声，胞体钙信号的准确度也大幅提高。量化分析表明，DeepCAD增强后的钙成像数据能够明显提升神经元分割（neuron extraction）和尖峰推测（spike inference）的准确度，有助于完整揭示神经回路活动，避免噪声导致的信息损失。
图3. DeepCAD用于神经群落钙成像的去噪，准确解析神经元活动
最后，作者将预训练的DeepCAD模型用于装配有不同物镜和探测器的多个双光子显微镜上，结果表明，DeepCAD具有良好的泛化性和可扩展性，在不同的双光子成像系统上均表现出优越的性能。
图4. DeepCAD在不同的双光子显微镜上均表现出优越的性能
为了简化DeepCAD的使用流程，作者将该方法封装为Fiji插件。目前相关代码、插件和完整数据集已随论文一同发布。除了神经钙成像，该方法有望扩展到其他成像模式，如宽场显微镜、共聚焦显微镜和光片显微镜，或者其他功能成像场景，如细胞迁移观测和电压成像。DeepCAD可作为在光子受限情况下延时成像（time-lapse imaging）的一般数据处理步骤，实现对生物动态活动的低激发功率、长时程观测。
图5. DeepCAD的Fiji插件
清华大学自动化系博士生李欣阳、张国勋为该论文共同第一作者；清华大学脑与认知科学研究院、清华大学自动化系戴琼海教授；清华大学深圳国际研究生院王好谦教授；清华大学电子系方璐副教授为该论文共同通讯作者。。
参考文献
1 Sabatini, B. L., Oertner, T. G. & Svoboda, K. The Life Cycle of Ca2+ Ions in Dendritic Spines. Neuron 33, 439-452, doi:10.1016/s0896-6273(02)00573-1 (2002).
2 Chen, T. W. et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature 499, 295-300, doi:10.1038/nature12354 (2013).
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