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SCI 、EI 收录,上海海洋大学研究新领域有所斩获

2021.8.20
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愿湫,十里亭

清风拂过十里亭,踏过春雪只待君。

  基于末端转移酶核酸信号放大技术的沙门氏菌比色适配体传感器

  张倩雯1,陈谦1,卞晓军1,2,3,颜娟1,2,3

  1上海海洋大学食品学院, 上海 201306

  2上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306

  3 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海), 上海 201306

  关键词:生物传感器, 适配体, 信号放大技术, 食源性疾病, 食品安全

  食品安全已成为当今世界性公共卫生的关注焦点,引发食源性疾病的首要因素是广泛存在的病原微生物。据统计,每年全球约有14亿由微生物导致的腹泻病例,而我国由沙门氏菌引起的食物中毒病例数频居榜首,因此,迫切需要开发可以满足食品安全领域现场快速检测需求的分析技术。

  适配体是在体外筛选获得的与特定目标物具有高亲和力的单链核酸序列(DNA或RNA)。适配体传感器是具有高稳定性的生物传感器,其制备简单、可采用电化学、荧光、比色和拉曼等多种检测策略。为了进一步提高适配体传感器检测的灵敏度,一些新技术和新材料如信号放大技术、磁性材料等被整合用于适配体传感器的构建。磁珠具有小尺寸效应和表面效应,可满足微量生物样本检测的要求;另外,磁珠表面易于化学修饰,便于构建磁性生物探针,并通过磁响应性能简化实验操作。此外,末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)是一种简单易行的核酸信号放大技术,它通过催化单核苷酸连接到寡核苷酸链的3’-OH端,实现长单链DNA的延伸,从而达到增强检测信号的目的。该过程无需扩增模板和反复的升、降温过程,适合食品安全现场快速检测的需求。

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  图1 基于末端核酸转移酶信号放大技术的S. typhimurium的比色适配体传感器原理图

  基于此,上海海洋大学的颜娟副研究员及其团队发展了一种基于醛基化磁珠、酶切技术和末端转移酶介导的信号放大技术的比色分析方法用于食品中鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)的检测。该比色传感器利用了磁珠的磁响应性、适配体与靶标的特异性识别以及特别设计的酶切识别碱基连接TdT信号放大技术(如图1)。当待测物中含有S. typhimurium时,适配体与其特异性识别、结合,从Mbs表面释放,并通过磁分离去除。留在Mbs表面的捕获探针因其序列含有互补配对碱基,自身回折并形成酶切识别位点,经EcoR I 酶切后,得到3’-OH 端。此末端在TdT 酶的催化作用下引发扩增反应,生成长单链DNA产物。随着Biotin-dUTP在长单链DNA中的不断嵌入,累积大量与streptavidin-HRP结合的生物素位点。通过HRP催化TMB 底物显色,产生肉眼可见的蓝色,最终实现对S. typhimurium识别反应及定量的比色信号;而当待测物中不含S. typhimurium时,由于捕获探针与适配体3’-OH端均被磷酸基团封闭,并且无酶切过程产生3’-OH端,无法引发TdT反应,从而不产生催化比色信号。

  该适配体传感器具有较高的灵敏度和特异性,对101~105 CFU/mL浓度范围内的S. typhimurium具有良好的响应性能,检出限低至21 CFU/ mL;牛奶样品中S. typhimurium的回收率为92.2%~112.7% (RSD<3%)。该适配体传感器操作便捷且具有良好的通用性,只需改变适配体序列,即可实现不同食品安全污染物的检测,有望作为低样品消耗、低成本分析的食品污染物的现场检测通用平台,在食品安全和污染物检测及监管方面具有良好的应用前景。

   作者简介

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  张倩雯

  第一作者:张倩雯(1996.1—),女,上海海洋大学硕士研究生,研究方向为DNA纳米技术用于食源性致病菌的快速检测。

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  颜娟

  通讯作者:颜娟(1982.06—),女,上海海洋大学,副研究员。

  主要从事:基于DNA纳米技术的生物传感策略在食品安全检测领域中的应用研究。


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