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Anal. Chem. 封面 | 微珠阵列芯片用于单细胞microRNA定量检测

ACS美国化学会
2021.9.10
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柔荑含莲

致力于为分析测试行业奉献终身

  英文原题:A Cascaded DNA Circuit in Bead Arrays for Quantitative Single-Cell MicroRNA Analysis

  近日,南京大学化学化工学院许丹科教授课题组报道了一种基于级联 DNA 线路的微珠阵列芯片,用于单细胞的 microRNA 定量检测。这项研究为实现单个细胞中 microRNA 的直接定量检测提供了一种新颖的恒温无酶分析策略。所设计的微珠阵列芯片只需 10 µL 的反应体系,避免了额外的油封步骤,且提供了足够的微珠用于精确定量,解决了单细胞分析中样本量少、灵敏度要求高等技术挑战。此外,级联 DNA 线路具有可模块化设计的优势,在降低成本的同时简化了分析环节。相关研究成果近期作为封面文章发表在 Analytical Chemistry 期刊上。

  单细胞的 microRNA(miRNA)分析有助于人们理解疾病的起因并制定新的疾病治疗策略。然而,单个细胞中的 miRNA 非常稀少,往往要经过酶促扩增反应才能进行准确定量。级联 DNA 线路技术由于其出色的信号放大效率和恒温反应过程而在核酸检测领域受到广泛关注。 

  近日,南京大学生命分析化学国家重点实验室许丹科教授课题组将级联 DNA 线路引入到微珠阵列芯片之中,构建了一种恒温无酶的单细胞 miRNA 检测新策略。微珠阵列芯片是一个包含六个流通池的便携式芯片,能够同时对多个样本进行 miRNA 的定量检测。微珠芯片的使用过程和检测原理如图 1 所示:首先,通过重力辅助发卡探针功能化的微珠加载到 COP 微孔阵列中形成均匀分布的微珠阵列。接下来,将 10 µL 样本载入设备并在 30℃ 下孵育 2 小时,以确保微珠捕获靶标 miRNA。通过移液器注入 1×TNaK 缓冲液以清洗未结合的 miRNA。然后,将发卡探针 H2、Cy3-h1 和 Cy3-h2 的混合物加载到阵列中以启动级联的 DNA 线路反应,最终将许多荧光标记的发卡探针富集在微珠的表面,通过使用显微镜成像系统对其进行扫描,分析出的荧光微珠数量可用于靶标 miRNA 定量。

  


图 1. 微珠芯片中的级联 DNA 线路的示意图

  研究中为了评估微珠阵列芯片中固液杂交系统的反应效率,研究者将浓度从 4 pM 到 40 nM 的 Cy3 标记的探针溶液与用其互补探针修饰的微珠孵育,通过杂交反应可将荧光标记的探针固定在微珠表面。分析结果显示,荧光微珠比例与在溶液中的荧光探针个数之间显示出良好的线性关系。鉴于此,研究者将无酶 DNA 线路作为信号增强策略引入此微珠阵列,利用级联 DNA 线路的指数级信号放大效率以及微珠上密集的发卡探针产生的局部高浓度实现了埃摩水平 miRNA 的检测。为了审视该方法的灵敏度能否胜任单细胞样品中的 miRNA 检测,选择浓度范围为 50 aM 至 500 fM 的 miRNA-155 作为样品。微珠阵列芯片的显微镜图像如图 2-A,校准条指示荧光图像中的荧光强度,而在明场图像中,含有微珠的微孔与不含微珠的微孔透光性不同。根据这些特点,研究者对显微镜图像进行颗粒分析,统计出每个样本的活性微珠占反应池中所有微珠的比例(fon%),作为最终的读取信号(图 2-B)。图2-C 显示了 fon% 与 miRNA-155 浓度的对数之间的良好线性关系,由此计算出 miRNA-155 的检测限为 16 aM。

图 2. 不同浓度 miR-155 的微珠阵列芯片的荧光显微镜图像以及微珠的分析

  与 miRNA 检测相关的挑战还包括识别不同 miRNA 之间的高度序列同源性。研究者通过添加不同数目的错配碱基和不匹配序列的干扰 miRNA(miRNA-21 和 miRNA-16)来评估该方法的特异性。如图 3 所示,空白对照和不匹配序列之间没有显著差异。对 miRNA-155 及其类似序列(miRNA-155a 包含一个错配碱基, miRNA-155b 包含两个错配碱基)分别进行微珠芯片检测,miRNA-155a 和 miRNA-155b 对应于 miRNA-155 中测得的活性微珠百分比的 20.9% 和 18.5%。此外,当单独使用 miRNA-155(100 fM)以及将其与更高浓度的不匹配序列(miRNA-21 为 10 pM 和 miRNA-16 为 10 pM)混合时,都测量到了相似的活性微珠百分比。这些结果表明,该方法不仅在区分 miRNA 方面具有很高的序列特异性,而且还具有抵抗更高浓度的其他 miRNA 干扰的能力。

图 3. 微珠阵列芯片的 miRNA 检测特异性评估

  更为重要的是,该微珠阵列芯片可用于测量 miRNA 表达水平的细胞间异质性,而无需进行逆转录反应。研究者评估了该方法对 Hek-293,HeLa,MCF-7 和 MDA-MB-231 四种细胞系的单细胞进行 miRNA 分析的能力。首先,从每个细胞类型中挑选了 6 个单细胞,并通过溶胀使其裂解,然后加热所得的单细胞裂解物以释放 miRNA,并直接作为样品进行微珠阵列检测。测得的每个细胞所含 miRNA-155 个数显示在箱形图中(图 4-B),可以看出,miRNA-155 在 MCF-7 中而不是在 HeLa 中过表达(P = 0.005),说明 miRNA-155 在乳腺癌细胞中的表达相比在人类正常细胞中显著上调;而转移能力强的癌细胞 MDA-MB-231 的 miRNA-155 表达水平明显高于转移能力较低的 MCF-7 细胞(P = 0.002)。

图 4. 微珠阵列芯片用于单细胞的 miR-155 检测

  本研究得到了中国国家自然科学基金(the National Natural Science Foundation of China)和南京大学卓越研究计划(Excellent Research Program of Nanjing University)的支持。感谢塔拉对封面原创设计的重要贡献。


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