从17世纪开始，现代生物学的发展就与显微成像技术紧密相关。然而，由于受光学衍射极限的影响，传统光学显微成像分辨率最小约为入射光波长的一半。因此，科学家们一直在不断努力，试图寻找突破光学显微镜分辨极限的方法。
在超分辨显微技术飞速发展的同时，现有成像技术的缺陷也日益显现，例如成像分辨率和成像时间不可兼得；对透镜制造技术提出了一定要求的同时，也限制了观测的视野；日益复杂的设备使得操作和维护也越来越困难……
为了解决上述问题,需要发展一些新型的超分辨技术以适应不同领域的要求。
现有超分辨技术在样品纵向图像的获取上可分为两类：
１) 通过增加可获取的信号纵深以更好地获取样品的三维图像，如双光子荧光显微技术等；
２)通过降低可获取的信号纵深以更好地获取样品表面的图像，如等离子结构照明显微技术(PSIM)和基于芯片的宽视场纳米显微术(CWN)等。
下面主要介绍第2类技术中的两种新型前沿显微技术，二者都是利用特殊材料的样品作为载物台对照明光进行有效的调制，以增强样品表面的成像效果。
等离子结构照明显微技术
PSIM是于2014年由WeiFF等在传统结构光照明显微(SIM)原理的基础上利用表面等离子体干涉(SPI)代替光学干涉，从而获得达到SIM两倍分辨率的新型超分辨显微技术，该技术的关键在于对表面增强拉曼散射(SERS)的应用。
近年来，SIM由于其光毒性低、成像速度快、适用于观察活细胞等优点得到了越来越广泛的应用，然而传统SIM由于原理上的限制只能达到衍射极限两倍左右的成像分辨率。PSIM将SIM与可调制的SPI结合起来，用SPI序列作为新的照明光源代替传统SIM中的激光干涉条纹，利用振镜扫描实现条纹变化，通过重建达到了相当于传统SIM两倍的分辨率。
图1 PSIM技术下的直径为100 nm的荧光颗粒。(a)传统的荧光显微；(b)重建的PSIM图像；(c)对应的SEM图像；(d-e)a，b两图的傅里叶变换，黄色虚线代表光学传递函数。(f)蓝色的为传统荧光成像的截面强度分布，绿色和红色为PSIM重建后的两个轴向分布
相比之下，PSIM主要有以下优点：
１) 高分辨率。与传统SIM技术和SSIM技术相比，PSIM的优势在于在不减帧速且不利用饱和荧光效应的前提下获得高分辨率的显微图像。
２) 高信噪比。倏逝波在垂直方向上快速衰减,通过将激发光限制在样品表面一个很小的区域内即可得到较高的信噪比。
３) 成像分辨率不依赖于NA。PSIM原理上不依赖于NA的限制,利用较小NA的物镜仍可获得比SIM更高分辨率的图像。
４) 极大的应用前景。对于诸如哺乳动物细胞等需要对其表面进行观测的样品，PSIM是一种能够较好地解决衍射极限问题、同时还具备较高对比度的成像手段。这种技术将在高速超分辨领域内产生巨大的影响。
芯片照明超分辨
基于芯片的CWN，简称芯片照明超分辨，利用照明光在波导片与样品界面处产生的瞬逝场使得样品仅在表面极薄的部分得到激发，从而减弱获取信号中背景信息的干扰，实现超分辨。
CWN技术是由Grandin等在2006年提出的，并由Diekmann等在2017年进行改进。Diekmann等利用波导片实现了照明光与探测光的完全分离，在原有的平板波导的基础上研制了可控能力更强的肋形波导和带状波导，如图2所示,将复杂的光学功能集成在以波导片为主体的通用平台上。
图2 波导片a.在原有平板波导的基础上部分蚀刻可制成肋形波导；b.在原有平板波导的基础上完全蚀刻至SiO2底板可制成带状波导。两种情形下波导通道的宽度都是25-500 μm
CWN的主要优点有：
１)波导片的应用将激发光路完全从显微系统中分离出去，使用时无需考虑光路的耦合，大大降低了整套设备的复杂度；
２)波导片利用光在高折射率材料和周围介质(水或细胞)间的界面上发生全内反射的原理，高效地利用瞬逝场照明样品；
３)由于其对照明光在空间上的严格限制，图像具有较高的信噪比；
４)由于照明光与成像光的物镜非相关，因此可以随意根据需要更换不同放大倍数/分辨率的物镜；
５)由于该技术对光信号的利用效率高，使用NA较小的物镜即可在获得较大视场的同时，确保图像的分辨率不至于太差。
Diekmann等利用两种互补的技术———ESI技术和直接STORM(dSTORM)技术，展现了基于波导芯片的超分辨荧光显微成像技术的功能。这项技术解决了一直以来存在于超分辨显微技术中的缺陷,提高了超分辨显微系统的应用性能，有极大的市场价值和开发前景。此外，该技术为研究者提供了新的思路，基于芯片的激光产生、过滤和调制技术将为超分辨显微领域带来发展的新动力。可以预见，未来的超分辨显微领域将会因为光子集成电路的发展而再次产生较大的飞跃。
偏振超分辨成像技术
荧光的基本物理尺寸包括强度(反映荧光浓度)、波长(吸收和发射光谱)、时间(荧光衰减寿命)和偏振(由偶极子取向产生)。想比于其他三个维度，偏振在超分辨领域的发展仍处于初级阶段。
2014年，Walla课题组提出了偏振调制超分辨(SPoD)技术。该技术在不需要结构光照明、开关调制以及闪烁荧光探针的条件下通过偏振调制以及偏振角度缩小实现了超分辨成像，将偏振引入超分辨显微成像领域。偏振调制数据采用SPEED反卷积算法进行解调，从而重构超分辨图像。该方法虽然可以实现超分辨，但重构期间会导致偶极子方向信息丢失。
而且，对于究竟是SPoD带来了超分辨还是SPEED重构算法带来了超分辨仍存在着争论。2015年，Keller等对此提出质疑并发表了针对这一文章的评论：利用荧光偏振不能够获得进一步的超分辨。Walla课题组一方面承认Keller等的观点，另一方面则用新的实验捍卫他们自己的工作。关于偏振调制能否带来超分辨信息目前仍然存在着争议。
2016年10月31日，北京大学席鹏课题组及其合作者提出了一种新的基于偏振偶极子方位角的SDOM技术。该技术利用稀疏增强反卷积算法代替了SPEED算法，同时从荧光强度和荧光各向异性等方面来考虑偏振调制能否带来更多超分辨信息，完美回答了上述争论问题，并在实现相同强度分辨率的条件下进一步获取了偶极子取向信息。
另一种偏振超分辨技术主要基于单分子成像。Cruz等提出的偏振解析dSTORM(polar-dSTORM)可在一帧中测量单个荧光偶极子，并通过随机切换开/关状态在其他帧中测量其他的偶极子取向，再通过重建获得整体的超分辨率图像。在polar-dSTORM中，为了保持单分子定位中的高信噪比，使用两个探测通道来实现平面取向内偶极子取向信息的测量，并忽略单个偶极子的摆动信息。通过重建算法计算每帧中单个分子的方位角和位置，可以实现单分子的准确定位和取向测量。
在Hafi、Zhanghao以及Cruz等的研究中，已经将偏振超分辨荧光显微镜运用到对海马切片、哺乳动物细胞和酵母细胞的观察之中。
相比于其他超分辨技术，利用偏振实现超分辨的优势在于：在不牺牲成像速度和样品毒性的前提下获取样品的超分辨信息；可在不影响原系统性能的条件下很容易与现有的成像系统相结合使用。因此，未来荧光偏振超分辨显微镜可在更多的生物领域中发挥作用。
还有一种不依赖于光学技术来突破衍射极限的方法，该方法是在衍射极限存在的条件下人为地放大生物样品，从而观察到更细微的结构信息。这便是我们接下来要讲述的利用化学方法将样品物理放大的膨胀样品超分辨成像技术。
膨胀样品超分辨成像技术
膨胀样品显微术(ExM)的概念是由Chen等于2015年提出的，该技术利用高吸水性分子吸水溶胀的特性，将样品物理放大以达到超分辨显微的效果。这种高吸水性分子最常见的用途之一就是婴儿尿布。我们知道在吹气球的时候，气球吹得越大，气球的厚度越薄，也就是说，我们想要让样本放得更大，就需要减少细胞中那个由高吸水性分子形成的网的密度，如此一来最大的问题便是细胞在溶胀过程中无法各向同性的扩大，会导致细胞结构变得极其不稳定，也就没有了观察的意义。
如何将一个样品在高度放大的同时保留其原有结构呢？
研究人员通过努力找到一种方法使得细胞在溶胀的过程中还可以保持其结构的稳定，而这种方法便是采用另一种高吸水性分子凝胶。在样本随着吸水分子的膨胀倍增之后，让凝胶去破坏原有吸水分子间的交联以保持样品结构的稳定，随后再次让样本膨胀，进一步放大它的尺寸。如此一来，样本可放大到20倍左右，分辨率达到25 nm。
ExM便宜、快速且分辨率高，在超分辨显微成像中已是一个巨大的突破，可实现常规超分辨光学显微镜可达到的效果。相比于传统显微镜，ExM的时间分辨率无附加限制，但空间分辨率可以达到25 nm。相比于原有超分辨技术，其样品制备要求与传统显微镜相同,因而适用范围较广。
表 几种新型成像方法对比
近年来，超分辨技术发展迅速，先后实现了多色、三维、活细胞快速成像。超分辨技术突破了传统光学成像中的衍射极限，将传统成像分辨率提高了2-20倍，其在生物领域中的应用也愈加广泛，实现了对细胞膜蛋白分布、细胞骨架、线粒体、染色质和神经元突触等诸多精细结构的观察，极大地加快了生命科学领域的研究进展。
但是，原有的超分辨成像技术受原理限制，在成像速度或分辨率水平等成像特性上很难再有突破，因此新型超分辨技术的发展显得尤为重要。
上述几种新型的超分辨技术在不同的应用中各有所长，为光学成像领域带来了新的曙光。随着人们对生命科学领域的不断深入探索，超分辨技术将会继续发展以满足不同的应用需求。未来需要在并行化、高速、活细胞和活组织方面，实现超高时空分辨活体成像。科研人员需要不断开拓思维来推动新型超分辨技术的发展，使得超分辨领域朝着3D实时动态活细胞成像的目标不断前进。
北京大学工学院席鹏课题组致力于光学超分辨成像技术与新型生物医学成像技术的研究。
参考文献
金录嘉,何洋,瞿璐茜,张弛,李美琪,席鹏 新型超分辨显微技术浅析[J]. 激光与光电子学进展, 2018, 55(3): 30006
超分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限（200nm）的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。
光学显微镜凭借其非接触、无损伤等优点，长期以来是生物医学研究的重要工具。但是，自1873年以来，人们一直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm，无法用于清晰观察尺寸在200 nm以内的生物结构。超分辨光学成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世纪光学显微成像领域最重大的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限（换言之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像），为生命科学研究提供了前所未有的工具。
光学显微镜的分辨率
1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值约为l / 2NA（分辨率极限公式），其中l是光波波长，NA是光学系统的数值孔径（Numerical Aperture）。
此后的研究表明，光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（称为艾里斑, Airy disc）的尺寸。另外，当一个艾里斑的边缘与另一个艾里斑的中心正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被人眼或光学仪器所分辨（这个判据称为瑞利判据，Rayleigh Criterion）。利用瑞利判据以及艾里斑的数学表达式，我们可以得到光学显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。值得指出的是，光学显微镜的分辨率公式跟前面提到的分辨率极限公式有所不同，而前者更广泛的被光学成像领域使用。
提高光学显微镜分辨率的途径
为了提高光学显微镜的分辨率，早期的工作往往集中在如何减小艾里斑的尺寸，包括减小光的波长、增大数值孔径。对于前者，直接导致了各种电子显微镜的诞生---采用波长为纳米甚至亚纳米级的电子束进行成像，其分辨率可达纳米量级甚至更小。对于后者，一方面可以更高折射率的成像介质，例如，将空气换为水（折射率为1.333），采用400 nm的光进行成像，极限分辨率可高达150 nm。另一方面，可以利用结构更为复杂的光学收集系统（如共轭双物镜）来增加光学显微镜的有效孔径角，从而提高光学显微镜相对较差的轴向分辨率，其典型代表为4Pi显微镜。此外，还可以使用共焦小孔等来限制艾里斑的尺寸并消除杂散光，从而提高光学显微镜的横向和纵向分辨率，其典型代表是共聚焦显微镜(Confocal Microscope)。
值得指出的是，这里所述的光学显微镜指的是远场光学显微镜（Far-field Optical Microscope），物镜和样本之间的距离远大于光的波长。进一步的研究表明，远场光学显微镜存在分辨率极限的主要原因在于远场一般只能收集传导波信号，而携带了高频信息的倏逝波（Evanescent Wave），其电场强度随传播距离的增加而呈指数衰减。因此，若使用距样本表面仅几个纳米的探针收集并探测近场光信号，可以大幅提高光学显微镜的分辨率，这种思路导致了近场扫描光学显微镜（Near-field Scanning Optical Microscope, NSOM）的诞生，其分辨率可以优于25 nm。而基于倏逝场扫描成像的光学显微镜，通常被称为近场光学显微镜（Near-field Optical Microscope）。
超分辨光学成像技术
超分辨光学成像技术通常指的是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法（如STED）。另一种是基于单分子成像和定位的方法（如PALM）。
1.受激发射损耗显微镜技术（Stimulated Emission Depletion Microscopy, 简称STED）
该成像理论来源于爱因斯坦的受激辐射理论，德国科学家斯蒂芬·赫尔(Stefan W. Hell)创造性地利用受激辐射来抑制自发荧光辐射，最终实现了受激发射损耗显微镜技术（STED）。一个典型的STED显微镜需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光（也称STED光）。利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态。随后，使用甜甜圈型（Doughnut，跟救生圈形状类似）的损耗光照射样品，使得处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这种照明方式的组合，将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得了一个小于衍射极限的荧光发光点。最后，通过在二维（或三维）空间内扫描共轴的激发光和损耗光，获得一幅二维（或三维）超分辨图像。1994年，斯蒂芬·赫尔等人提出了STED显微镜的理论。2000年，斯蒂芬·赫尔研究组通过生物实验证实了STED显微镜的超分辨成像能力。
2.光激活定位显微镜技术(Photoactivation Localization Microscopy, 简称PALM)
阿贝极限指出，在远场无法分辨相距l / 2NA的两个荧光分子所成的像，但是并没有对单个荧光分子的中心位置确定精度进行限制。如果在艾里斑内仅有一个分子在发射荧光, 我们可以利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度（纳米量级）获得荧光分子的中心位置。倘若将这个单分子定位思想用于实现超分辨成像，其关键在于如何在一个艾里斑内区分多个荧光分子。
为了克服一个艾里斑内只允许一个分子发射荧光的限制,1995年美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)通过理论分析，提出可以利用光谱特性对艾里斑内的发射波长不同的荧光分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。2006年， 埃里克·白兹格等人利用光激活绿色荧光蛋白（PA-GFP）的可控荧光开关特性，结合单分子定位算法，实现了生物样本的超分辨成像。他们首先利用低能量的 405 nm 激光（激活光）来稀疏活化PA-GFP，再使用 561 nm激光（激发光）对活化后的PA-GFP进行单分子荧光成像，直至活化后的PA-GFP分子被光漂白。重复激活-激发-定位-漂白过程，可以在艾里斑内高精度找到大量PA-GFP分子的中心位置，从而重建出一幅由PA-GFP分子中心位置组成的超分辨图像。这种技术被称为光激活定位显微镜(Photoactivation Localization Microscopy, 简称PALM)。
2006年，哈佛大学的庄小威小组提出了随机光学重建显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM），其成像原理与 PALM 类似，但是在密集标记样本内实现荧光发射稀疏化的方案有所不同。
2014年诺贝尔化学奖
2014年10月8日，瑞典皇家科学院宣布，将2014年诺贝尔化学奖授予美国霍华德·休斯医学研究所的埃里克·白兹格(Eric Betzig)，德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的斯蒂芬·赫尔(Stefan W. Hell)，美国斯坦福大学的威廉·莫尔纳(William E. Moerner)，以表彰他们在超分辨荧光成像技术领域取得的成绩。
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