比色法操作的注意事项

 噻唑蓝（MTT）比色法操作注意事项

 噻唑蓝（MTT）：四唑盐

1. 原理：

   MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。

2. 优点：简单快速、灵敏、经济

3. 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

4. 应用：新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等

5. MTT主要有两个用途

   1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

   2） 细胞增殖及细胞活性测定。

6. 比色法操作注意事项

   1） 选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满。

   2） 种板技术：均匀。

   3） 实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。

   调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）

   溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶。

   加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物。

   （一般5-7个梯度，设3-5个复孔）

   4）避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

   5）边缘效应：周边孔加入PBS。

   6）MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液。4℃下避光保存2周。

   7）孔板的重复利用（1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾
   干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3
   遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。或泡酸过夜，dd水冲洗干净，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。

   8）MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

   9）在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

   10）MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套。

   11）配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以操作台上的照明灯关掉。