目前广泛采用的 DNA 测序方法有化学法和双脱氧法两种,它们对模板的需要量比较大。利用 PCR 方法可以比较容易地测定位于两个引物之间的序列。利用 PCR 测序有下列几种方法。
(1)双链直接测序
将 PCR 产物进行电泳回收或利用分子筛等方法除去小分子物质。采用热变性或碱变性的方法使双链 DNA 变成单链,与某一方向引物退火,在 PCR 系统中加入测序引物和4种中各有一种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的底物,即可按 Sanger 的双氧链终止法测定 DNA 序列。用这种方法测序时,一次测定的距离较短,同时容易出现假带。
(2)双链克隆后测序
为避免双链直接测序的缺点,可以将 PCR 扩增产物直接克隆到 M13载体中,通过提取单链后进行序列测定。
(3)基因扩增转录序列
在 PCR 时,使用一个5'端带有 T7 启动子的序列,扩增后在 T7 RNA 酶作用下合成 mRNA 作为模板,可逆转录酶测序。
(4)不对称 PCR 产生单链测序
在 PCR 反应中加入不等量的一对引物,经过若干循环后,其中一种引物被消耗尽,在随后的循环里,只有一种引物参与反应,结果合成了单链。
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