1、试剂
(1)10倍 RT 缓冲液:500mmol/L Tris·Cl(pH8.0),0.60 mmol/L MgCl2,400mmol/L KCl,10mmol/L DTT。
(2)10倍 PCR 缓冲液:100mmol/L Tris·Cl(pH8.3),500mmol/L kCl,15mmol/L MgCl2,0.1%明胶。
(3)2mmol/L dNTPs。
(4)100U/μL M-MLV 逆转录酶。
(5)Oligo(dT)。
(6)25mmol/L MgCl2。
(7)TaqDNA 聚合酶。
(8)100ng/μL 引物。
(9)RNasin。
2、以总 RNA 为材料的 RT-PCR 方法
(1)cDNA 第一链合成 取 0.5mL 新的无菌硅化的 Eppendorf 管,加入100ng～5μg 的总RNA样品,再加入蒸馏水至12.5μL,混匀。
加入3μL oligo(dT),混匀,68℃保温5min,降温至30℃保温5min,最后降至0℃,200保温5min。取出加入如下试剂:2μL dNTPs,10倍 RT 缓冲液 2μL,M-MLV(100U/μL)0.5μL,混匀,37℃下反应45min,-20℃放置。
(2)PCR 反应 取 0.5mL 新的无菌硅化的 Eppendorf 管,依次加入如下试剂:cDNA 反应混合液3μL,10倍 PCR 缓冲液(无Mg2+)2μL,25mmol/L MgCl2 1.2μL,2mmol/L dNTPs 2μL,引物(100ng/μL)各1L,Taq 酶 1.5U,加双蒸水至 20μL,混匀,加矿物油一滴(约50μL),置 PCR 扩增仪中,94℃变性40s,55℃退火1min,72℃延伸1.5～2min,循环25～35次,72℃延伸10min。用 Parafilm 将矿物油移去。
(3)取 5μL 电泳检测。
3、以 mRNA 为材料的 RT-PCR 方法
(1)逆转录反应 取 0.5mL 新的无菌硅化 Eppendorf 管中依次加入以下试剂:10倍 PCR缓冲液2L,dNTPs Oligo(DT)lμL,RNasin lμL, mRNA lμL,MgCl22μL逆转录酶100U,重蒸水加至 2μL,混匀,42℃保温 1h。
(2)终止逆转录反应 95℃水浴加热 5min,取出离心管,置离心机中,数千转离心数秒,备用。
(3)PCR 扩增依次加入以下试剂:10倍 PCR 缓冲液3L,3引物2.5μL,5引物2.5μL,dNTPs 2μL,TaqDNA 聚合酶1μL,混匀后加入 50μL 矿物油,95℃变性1min,45～50℃退火1.5min,65～72℃延伸1.5～2min,循环25～35次,72℃延伸10min。
(4)电泳检测。
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