酶联免疫法
测定原理:酶标抗体与肠毒素特异结合,加入底物后发生显色反应。
(1)试剂
①肠毒素酶联免疫检测试剂盒。
②洗液:在一个塑料洗瓶内,用 1L 蒸馏水或去离子水稀释浓洗液(试剂1号)。
③样品添加剂:试剂2号。
④阳性对照:使用前,试剂3号与洗液按1:100稀释,稀释时必须用聚丙烯塑料管。
⑤阴性对照:试剂4号。
⑥结合剂:吸取5mL结合剂稀释剂(试剂5号)于结合剂(试剂6号)的小瓶内,于室温下缓慢混合。然后再将6号小瓶的试剂倒入5号小瓶内缓慢混合。
⑦底物:把底物稀释剂(试剂7号)加入底物(试剂8号)内,在室温下完全溶解。
⑧终止液:试剂9号。
⑨2%次氯酸钠。
⑩0.25mol/L PH8.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液:称取 Tris 30.28g,加 800mL 蒸馏水使其完全溶解。加 6mol/L HC1 30mL混匀、调PH8.0,定容1L。
⑪尿素。
⑫聚乙二醇(PEG,MW20000)。
(2)设备和材料
①均质器及均质杯(250mL)。
②离心机及离心杯(250mL)。
③磁力搅拌器。
④聚丙烯三角烧瓶(250mL)。
⑤聚丙烯离心管(10mL)。
⑥透析袋(MW12000～14000)。
⑦微量加样器(1～200μL可调节)。
⑧注射器(5mL)。
⑨塑料洗瓶。
⑩脱脂棉。
⑪培养箱。
(3)操作步骤
①称取蘑菇罐头中的汤和固形物各5g,置于均质杯中,加入0.25mol/L PH8.0的 Tris 缓冲液 100mL,高速均质 3min。
②均质后的混合物转入离心杯中,以 4500r/min 离心 30min。
③上清液倒入一容器内,待做尿素处理用。
④尿素处理:量取 100mL 上清液,加入 6g 尿素,在聚丙烯三角瓶中混匀,在磁力搅拌器上,25℃缓慢搅拌4～5h。
⑤处理后的样品液,装入透析袋内,包埋于 PEG 中,4℃浓缩过夜。
⑥用自来水彻底冲洗透析袋表面的 PEG。
⑦将洗净后的透析袋浸入 0.25mol/L PH8.0的 Tris 缓冲液中平衡 5min,样品量不足5mL的可加入 Tris 液补足至 5mL。
⑧将样品液移入 10mL 离心管中,3500～4000r/min 离心 10min。
⑨准备 1 支 5mL 注射器,加 0.5 cm 厚的脱脂棉并用 5 mL 蒸馏水挤压紧。
⑩离心后的上清液用带脱脂棉的注射器过滤。
⑪测定滤液 PH 值,并根据具体情况用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 调 PH 值为7～8。
⑫在样品液中加入 100μL 样品添加剂(试剂 2 号),混匀,待做 ELISA 试验。
(4)检测
①从4℃冰箱中取出试剂盒放至室温,将小孔插入可拼装式酶标板的托盘,每一个孔做一个样品,同时再用两个孔分别做阳性对照和阴性对照。
②在每孔中加满洗液,20～25℃浸泡10min。
③弃去洗液,翻转托盘,倒扣在滤纸上以吸干残留的洗液。
④每孔加入 200μL 的样品,同时在阳性对照孔中加 200μL 阳性对照物,在阴性对照孔中加入 200μL 阴性对照物(试剂4号)。在样品记录表上记下每一样品的情况,加盖,37℃温育 2h。
⑤取出酶标板,按下列步骤对每一孔用洗液重复洗涤3次。迅速翻转酶标板,将内容物倒入盛有2%的次氯酸钠溶液的水槽内。将酶标板倒扣在滤纸上,以吸干残留的液体。每孔加满洗液。
⑥每孔中加入 200μL 的结合剂(试剂6号),加盖,20～25℃,1h。
⑦按照⑤方法重复洗涤 5 次,翻转酶标板,倒扣于滤纸上以吸干残留的液体。
⑧每孔中加入 200 μL 的底物(试剂8号),加盖,20～25℃,30～45min。
⑨每孔中加入 20 μL 终止液(试剂9号),混匀,对照比色卡观察试验结果,也可用酶标仪测定每一孔的吸光度,并做好记录。
(5)结果判定
①阳性对照应显示为深绿色,且吸光度大于1.0,表明所有试剂有效。
②达到下列标准的样品被判为阳性。阴性对照在比色卡的阴性范围内,吸光度小于0.2;样品的显色深于或相同于比色卡上阳性范围的颜色,或吸光度大于0.2。
③达到下列标准的样品被判为阴性。阴性对照在比色卡阴性范围内,吸光度小于0.2样品的显色在比色卡的阴性范围内或吸光度小于0.2。
④使用酶标仪,在414nm±10nm 波长可读取样品的吸光度。双波长读数仪用空气调零点,第二参考波长应指在490nm±10nm。
⑤若阴性对照的吸光度大于0.2,有可能是酶标板未洗净,该试验应重复。
⑥为避免因非特异性反应导致结果出现假阳性,当对样品阳性结果有怀疑时,可用正常兔血清按1:1的比例与样品在37℃下作用1h后,重复上述试验。
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