免疫亲和柱荧光计快速分析法测定赭曲霉毒素的过程

免疫亲和柱荧光计快速分析法赭曲毒素是赭色曲霉属和几种青霉属真菌产生的一种毒素,包括 A,B,C 等7种结构类似的化合物,其中以赭曲毒素 A 毒性最大。下表列出了世界各国对各种商品中赭曲毒素 A 存在情况的研究结果。

(1)仪器设备与试剂

真菌毒素专用荧光分析仪。

OchraTest 赭曲霉毒素免疫亲和柱。

荧光分析仪校准溶液:称取3.40g 二水硫酸奎宁,用0.05mol/L 的稀硫酸稀释至100mL。

1%NaHCO₃:10g NaHCO₃加1000mL的纯水。

甲醇:1%NaHCO₃(70+30):提取液每周配制一次。

乙腈-水(60+40):600mL乙腈+400mL水。

甲醇-水(80+20):800mL乙腈+200mL水。

15%氯化钠/2%碳酸氢钠:150g NaCl+20gNaHCO₃+1000mL纯水。

2.5%氯化钠/0.5%碳酸氢钠:25gNaCl+5gNaHCO₃+1000mL纯水。

PBS:称8.00gNaCl+1.2g Na₂HPO₄+0.2g KH₂PO₄+0.2g KCl,用990mL 纯水将上述试剂溶解,然后用浓 HCl 调 pH 值至7.0,最后用纯水稀释至1000mL。

PBS/2%吐温-20清洗缓冲液:20mL吐温-20+980mL PBS。

PBS/0.01%吐温-20清洗缓冲液:20mL吐温-20+980mL PBS。

真菌毒素清洗缓冲液:将25g NaCl(氯化钠)+5gNaHCO₃(碳酸氢钠)+0.1mL吐温-20加入到1L 的纯水中。

(2)分析测试操作步骤

①仪器标定与空白试验

a.标定荧光计。

b.试剂空白试验(1.55mL OchraTest 淋洗液),荧光计读数应为0。

c.空白试验(2mL 纯水置于测试管中),荧光计读数应为0。

②样品提取

a.称取25g 磨细的样品,置于搅拌杯中。

b.加入50mL 甲醇+1%碳酸氢钠(70:30,体积比)溶液。

c.盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1min。

d.取下盖子,将提取物通过折叠式滤纸过滤,滤液收集于干净的容器中。

③提取物的稀释

a.移取10mL 上步的滤液,置于干净的容器中。

b.用40mL PBS+2%吐温-20清洗缓冲液将滤液稀释,混匀。

c.将上步稀释液通过微纤维滤纸过滤,滤液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL。

④分离柱色谱操作

a.将上步10mL 滤液,以1～2滴/秒的流速全部通过 OchraTest 亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

b.将10mL PBS/2%吐温-20清洗缓冲液以1～2滴/秒的流速通过亲和柱。

c.将10mL 纯水以1～2滴/秒的流速通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

d.用1.5mL OchraTest 淋洗液以1滴/秒的流速淋洗亲和柱,将所有样品洗脱液(1.5mL)收集于玻璃测试管中。

e.混匀后,立即将测试管置于已标定好了的荧光计中。60s后,读数。

⑤检测限:内推为1μg/kg。测定范围:0～100μg/kg。