免疫酶技术中常用的酶-底物系统

各种免疫酶技术,最终都是以某种显色反应而揭示待测物质来进行定性和定量分析。不同酶要选择相应的底物,见下表。

免疫酶技术中常用的酶-底物系统

酶结合物催化作用随时间的延长而增强。但随着酶催化时间的延长,某些底物会产生自发的变性,使最终颜色反应加深而干扰结果判断。产物产生的多少(反应产生颜色的深浅)与 H₂O₂ 的用量有很大的关系,故在底物溶液配制时应注意控制 H₂O₂ 的用量。由于这是氧化还原反应,无色供氢体可被空气中的氧氧化,因此底物溶液必须临用时配制(可在临用前加 H₂O₂),以保证新鲜,另外要控制好酶促反应时间,常掌握在20～60min之间。

用 ELISA 法检测半抗原时,由于它不能被聚苯乙烯反应板吸附,故而不能直接进行检测。目前最常用的方法是用半抗原载体蛋白结合物的形式包被。例如将半抗原与牛血清蛋白偶联产物免疫动物制备抗半抗原的抗血清或单克隆抗体,再用半抗原与卵清蛋白偶联产物进行包被和检测。但这种方法制备的包被抗原重复性不好,在贮存中不稳定,且易与抗血清发生交叉反应。为了解决半抗原吸附问题,Verschoor 等报道用尼龙(如尼龙-6)作为半抗原的载体,用二环己基碳二亚胺(dicyclorexylcarbo,Dcc)为交联剂制备半抗原-尼龙结合物。它不仅在室温放置稳定,且用苯酚乙醇溶解后即可在聚苯乙烯反应板上包被。也有的用戊二醛将含有氨基的半抗原直接与微孔反应板连接。总之,用 ELISA 法测定半抗原是很困难的。

在提高 ELISA 法的灵敏度方面,可采用预先将抗体、酶标抗抗体混合,使之充分结合后,再加入到包被抗原中。也有的采用多种酶的放大系统,如采用形成酶:抗体-抗原-酶:复合物的两种酶的级联放大系统,使灵敏度大大提高。

在 ELISA 法检测中,非特异性反应会有严重的干扰作用。在包被液中加入牛血清清蛋白或白明胶,在洗涤液中加入吐温-20(吐温-月桂酸)都是为了减少非特异吸附的。目前诸多的检测试剂盒是用单克隆抗体代替多克隆抗体,这样可提高免疫反应的特异性,减少非特异反应的干扰。

目前,ELISA 法测定技术与其他技术结合已发展为专门的分析方法,如与电泳技术结合的免疫印染技术,与层析结合的层析-ELISA 技术等。特别是免疫印染技术在生物化学、分子生物学的应用,已相当成熟和广泛。

 ELISA 法可检测范围在 ng 至 pg 水平,属于超微量分析技术。显然它对试剂、蒸馏水、微孔板以及实验各步骤的反应条件和操作都有严格要求。但如果实验结果不理想,也还是要从上述几方面及抗原抗体比例方面寻找原因。