1、测定原理
测定的基本反应原理是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔 IgG(盐酸克伦特罗抗体)的羊抗体盐酸克伦特罗抗体被加入,经过孵育及洗涤步骤后,加入盐酸克伦特罗酶标记物标准或样品溶液。盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗酶标记物竞盐酸克伦特罗抗体,没有连接的盐酸克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质(过氧化尿素)和发色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm 处测量,吸收光强度与样品中的盐酸克伦特罗浓度成反比。
2、试剂
(1)包被有兔 IgG 抗体的96孔板(12条×8孔)。
(2)盐酸克伦特罗标准水溶液。
(3)盐酸克伦特罗过氧化物酶标记物浓缩液。
(4)盐酸克伦特罗抗体浓缩液。
(5)含有过氧化尿素的酶基质。
(6)四甲基联苯胺发色剂。
(7)1mol/L 硫酸反应停止液。
3、样品处理
(1)带有低脂肪的肝,肉或组织
①5g粉碎的样品与25mL 50mmol/L HCl合,振荡1.5h,以达到均质的目的。
②称6g 均质物(相当于1g 肝脏),加入离心瓶中,离心15min,4000g 离心力或更高的转速,在10～15℃(非常重要)转移上清液到另一个离心瓶中,加300μL 1mol/L NaOH混合15min。
③加入4mL500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0),简单地混合并在4℃保存至少1.5h或过夜(非常重要)。
④离心15min,4000g 离心力或更高的转速,在10～15℃(非常重要)分离全部上清液(应该是清亮的),使其升至室温(2024℃),然后用 RIDA C18柱纯化。
(2)肉和组织
①5g 粉碎的样品与25mL 50mmol/Tris冲液(pH8.5)混合,振荡0.5h,以达到均质的目的。
②加入15mL庚烷(n-heptane)振荡5min 以除去脂肪,离心5min,4000g 离心力或更高的速度,10～15℃。
③用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层,再用15mL 庚烷(n-heptane)重复以上步骤。
④向均质的肉液中加入0.5mL 半浓的盐酸,振荡1h。
⑤称6g 均质物(相当于1g肝脏),加入离心瓶中离心15min,4000g 离心力或更高的转速,在10～15℃(非常重要)分离全部上清液(应该是清亮的),使其升至室温(20～24℃),然后用 RIDA C18柱纯化。
(3)饲料样品处理方法
①配合饲料样品处理方法
a.用乳钵研碎饲料样品,称2.0g 研碎的饲料样品,加入2mL 1mol/L HCl,加入16mL 双蒸水均质,旋流3min,放振荡器上振荡15min。
b.离心20min(2000r/min),转移出上清液并加人2mL1mol/L NaOH至上清液中混合,检查pH值是否在6.5～7.5之间。
c.离心20min(2000r/min),转移出上清液,如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤。
d.用双蒸水10倍稀释上清液(加100μL 上清液到900μL 双蒸水中并且混合好),此时样品总的稀释倍数为100。
e.取20μL 稀释的上清液用试剂盒进行分析。
②预混饲料及浓缩饲料样品处理方法
a.用乳钵研碎饲料样品,称2.0g研碎的饲料样品,加入2mL1mol/L HCl,加入16mL双蒸水均质。
b.旋流3min,放振荡器上振荡15min。
c.离心20min(2000r/min),转移出上清液并加入2mL1mol/L NaOH至上清液中混合,检查pH值是否在6.5～7.5之间;
d.离心20min(2000r/min),转移出上清液,如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤。
e.用双蒸水50倍稀释上清液(加100μL 上清液到4.9mL 双蒸水中并且混合好)。
f.取20μL 进行分析(此时样品总的稀释倍数为500)。
样品制备已完成,如果进行半定量分析,可以选择试剂盒中的一个标准作为临界标准值(建议选择浓度为900ng/g 标准液),结合 RIDASCREE Clenbuterol Fast 直接测定,目测颜色,较标准孔颜色浅为阳性,反之则为阴性。如果要进行定量分析,必须考虑到应将样品中可能含有盐酸克伦特罗的浓度用双蒸水稀释至试剂盒的可测定范围之内,再使用试剂盒进行分析。
如果希望提高测定的灵敏度可以减少稀释倍数。如果样品中盐酸克伦特罗浓度超出试剂盒的测定范围请在测定前酌情增加稀释倍数为了得到以 ng/g 为单位的饲料样品的结果,乘以稀释倍数。
4、RIDA C18柱纯化步骤
所有试剂和样品处理必须在室温条件下(20～24℃),并严格控制过柱时的流速(非常关键)。
(1)用3mL 甲醇(100%)洗涤柱子,流速为1滴/秒。
(2)用2mL 洗涤液洗涤柱子(50mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0)。
(3)样品进柱(肝、肉或组织的全部上清液)。
(4)用2mL 洗涤液洗涤柱子(50mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0)。
(5)用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2min干燥柱子。
(6)用1mL 甲醇(100%)洗脱样品,流速为15滴/分。
(7)在50～60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂。
(8)用1mL 蒸馏水溶解干燥的残留物,取20μL 进行分析。
5、测定步骤
室温20～24℃条件下操作。
(1)将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验,记录下标准和样品的位置。
(2)加入100μL 稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部,在室温孵育15min。
(3)倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体;用250μL 蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,再重复操作两遍。
(4)加入20μL 的标准或处理好的样品到各自的微孔中,标准和样品做两个平行实验。
(5)加入100μL 稀释的酶标记物到微孔底部,室温孵育30min。
(6)倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。
(7)用250μL 蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,再重复操作两次。
(8)加入50μL 基质和50μL 发色试剂到微孔中,充分混合并在室温暗处孵育15min。
(9)加入100μL 反应停止液到微孔中,混合好在450nm 处测量吸光度值(以空气为空白),必须在加入停止液后60min 内读取光度值。
6、结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100,因此0标准等于100%并且以百分比的形式给出吸光度值。
标准的吸光度值(或样品)/0标准的吸光度值×100=吸光度值%
计算的标准值绘成一个对应盐酸克伦特罗浓度(ng/kg)的半对数坐标系统曲线图,校正曲线在200～2000ng/kg 范围内应当成为线性,相对应每一个样品的浓度(ng/kg)可以从校正曲线上读出。
7、灵敏度
试剂盒的平均检测下限约为100ng/kg。根据样品处理记录,组织中的检测下限为40ng/kg。
首页
