放射性标记探针与核酸杂交反应的步一般过程

1、配制所需试剂

SSC 溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。

Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g,加水至500mL。

预杂交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100μg/mL 经变性或断裂成片段的鲑精 DNA。

2、操作步骤

(1)将含靶核酸的 NC 膜漂浮于6×SSC 液面,使其由下至上完全湿润,并继续浸泡2min。

(2)将湿润的 NC 膜装入塑料袋中,按0.2mL/cm² 的量加入预杂交液,尽可能挤出气泡,将袋封口,置68℃水浴1～2h 或过夜。

(3)将双链探针做变性处理使成单链,即于100℃加热5min,然后立即置冰浴使骤冷。

(4)从水浴中取出杂交袋,剪去一角,将单链探针加入,尽可能将袋内空气挤出去,重新封口,并将杂交袋装入另一个干净的袋内,封闭,以防放射性污染。

(5)将杂交袋浸入68℃水浴,温育8～16h。

(6)取出杂交袋,剪开,取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC 和0.5%SDS 中,室温振荡5min,勿使滤膜干燥。

(7)将 NC 膜移入盛有大量2×SSC 和0.1%SDS 溶液的容器中,室温漂洗15min。

(8)将 NC 膜移入一盛有大量0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,37℃漂洗30min 至1h。

(9)将 NC 膜移入一盛有新配0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,68℃漂洗30min 至1h。

(10)取出滤膜,用0.1×SSC 室温稍稍漂洗,然后置滤纸上吸去大部分液体,待做杂交信号的检测。